[发明专利]CHO/CERT细胞系

说明书

发明背景 

技术领域

本发明系关于细胞培养技术之领域，明确言之，系关于产生含有载体构建体之宿主细胞系之领域，该载体构建体包括神经酰胺转移蛋白质(ceramidetransfer protein；CERT)表达盒。相较于非转基因细胞系，该等细胞系具有经改善之分泌特性。 

背景 

生物药剂用于人类疗法的市场持续快速成长，在2010年，超过900种生物药剂正以临床研究进行评估，且预估有500亿销售额。近几年中，由于哺乳动物细胞能正确地加工及修饰人类蛋白质，因此有越来越多的生物药剂系产自哺乳动物细胞。因此，从哺乳动物细胞成功且高产量地产生生物药剂至关重要，且其系取决于工艺中所用重组单克隆细胞系之特性。 

由于大多数生物药剂产品是在生产过程期间从细胞所分泌之蛋白质，因此，针对新颖性宿主细胞工程化策略而言，生产用细胞系之分泌运送机制是另一个关注的标的。 

蛋白质分泌作用是一种复杂的多步骤机制：注定被运送至胞外空间或外质膜之蛋白质首先系以共翻译方式输送至内质网。于该处，该等蛋白质被封装于脂质囊泡中，并被运送至高尔基体，且最终从跨高尔基网络(trans-Golginetwork；TGN)运送至质膜，在该处将蛋白质释放至培养基中。 

许多工程化方法已采用日益了解可驱使诸如转录及翻译之过程，以增加该等步骤产生蛋白质产量的分子网络。然而，对于任一多步骤生产过程而言，解决系列过程中早期步骤的瓶颈可能会使得在下游(尤其是翻译后)产生瓶颈。已有报导指出，高到某一阈值以上，生产用细胞之比生产力系与产物基因之转录作用水平呈线性关连性。然而，在mRNA水平进一步加强产物表达会导致蛋白质合成作用、折叠或运送机制的负荷超载，而导致蛋白质产物在胞内累积。事实上，在现有之制造方法中经常看到此现象。 

因此，有需要改善用于产生重组蛋白质之宿主细胞的分泌能力。此在与新颖性转录加强技术组合时，及在高滴度工艺中甚至更为重要，以防止翻译后之瓶颈及蛋白质产物之胞内累积作用。 

然而，先前以翻译后机制为标靶之方法未竞全功，反倒是会因研究所用的细胞系或产物、或初始生产力水平而产生了相反的结果： 

-过度表达ER-驻留型分子伴侣蛋白BiP(结合蛋白质BiP/GRP78)意外地导致分泌减少； 

-酶蛋白二硫化物异构酶(protein disulfide isomerase；PDI)的加强表达显示具有相反的结果。 

使用转录因子X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1)(XBP-1)之分泌工程化方法经发现不是没有作用，就是在加强分泌的同时使凋亡性细胞死亡增加，导致表型不稳定，且阻碍了高度表达XBP-1克隆之分离。 

因此，在达成对分泌运送机制之目标操纵的道路中，目前存在两种主要阻碍：仍然有限之关于潜在调节机制之知识，及需要防止生产用细胞同时出现生长抑制或凋亡反应。 

发明概述 

本发明阐述两种特定且新颖之生产用宿主细胞系CHO/CERT 2.20及CHO/CERT 2.41。该等于2009年4月2日以编号DSM ACC2989(CHO/CERT2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之两种细胞系为用于产生重组蛋白质之理想宿主细胞系，因为其具有经改善的分泌能力、及良好的生长特性。 

我们最近已证明，藉由使与类固醇生成急性调节相关之脂质转移(START)域家族中之蛋白质(较佳为神经酰胺转移蛋白质(CERT))过度表达的分泌工程化方法，提供一种有效改善蛋白生产之方法，该蛋白质系从真核细胞经由分泌途径所运送的。参见以引用的方式并入文中之Florin等人，2009及专利申请案WO 2008/107388。 

CERT(亦称为古德巴斯得抗原结合蛋白质(Goodpasture antigen-bindingprotein))为一种细胞溶质蛋白质，该蛋白质对于将神经酰胺从其在内质网(ER)产生位置处以非囊泡方式运送至高尔基膜具有重要性，于高尔基膜处，可将神经酰胺转换成成鞘磷脂(SM)(Hanada等人，2003)。 

我们现在可证实，带有Ser→Ala点突变，且不再被蛋白激酶D磷酸化之 CERT突变体S132A比野生型蛋白质可明显更有效地加强分泌。 

更进一步，我们现在证明，CERT S132A表达水平系与其分泌加强效应具有关联性，其意指：细胞中异源CERT S132A水平越高，该细胞之分泌能力越强(图2)。