[发明专利]用于核苷酸突变鉴定的探针组及用于核苷酸突变鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于鉴定核苷酸突变位点的核苷酸类型的探针组，和用于鉴定核苷酸突变的方法。本发明还涉及用于鉴定涉及病毒和/或类似物的抗药性的突变的探针组，和用于鉴定突变的方法。

背景技术

核苷酸突变(包括核苷酸多态性)是对生物体表型具有很大影响的因素，并且为了预测其表型或预测药物的效果经常进行突变类型的研究。用于鉴定突变核苷酸类型的已知方法的实例包括直接测序、侵入方法、使用其上固定多态性特异性探针的DNA芯片的方法和等位基因特异性PCR方法，但是考虑到鉴定和检测灵敏度所需的劳动这些方法是不充分的，因此需要允许更简单和更灵敏地鉴定突变核苷酸类型的方法。

此外，尽管非专利文献1公开了使用锁核酸(LNA)鉴定核苷酸错配的方法，但是该方法基于通过与靶序列杂交的检测。

丙型肝炎病毒(以下也称作HCV)是导致人类肝脏紊乱的感染原(infectant)，并且已揭示在日本大多数非甲非乙型肝炎是由于HCV引起的。还揭示感染HCV的慢性肝炎患者病变发展为肝硬化或肝细胞癌，并且通过输血的感染也已成为问题。

已使用干扰素和利巴韦林等作为HCV的治疗药，但是，近年来，开发了蛋白酶抑制剂。然而，已报道取决于病毒的类型，存在蛋白酶抑制剂对其无效的突变型病毒，因此对于有效治疗重要的是，初步检测突变类型并且基于其结果确定给药方针。

然而，对于常规测试方法检测低拷贝数的病毒是困难的，因此需要允许准确和高灵敏度检测的方法。

作为检测HCV蛋白酶抑制剂抗性突变的方法，已报道了TaqMan错配扩增突变测定(Mismatch Amplification Mutation Assay)方法(非专利文献2)。在该方法中，将错配引入到引物，并且仅在存在期望的突变序列的情况下检测扩增信号。因此，在获得阴性结果的情况下，突变的鉴定需要另外的测定，该方法是不充分的。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Nucleic Acid Research，2006，34卷，8期，e60

非专利文献2：Journal of Virological Methods，2008，153卷，p156-162

发明内容

本发明旨在提供通过其可更简单和高灵敏度地鉴定核苷酸突变的方法，和为此使用的试剂。本发明还旨在提供用于鉴定涉及抗药性等的病毒基因组中的突变的方法，和为此使用的试剂，更具体地，提供确定HCV-1b型病毒的NS3蛋白酶基因中的核苷酸突变的方法，和为此使用的试剂，所述核苷酸突变用于预测个体对蛋白酶抑制剂的响应性。

本发明人深入研究以解决上述问题。作为结果，本发明人发现通过使用下述探针组进行实时PCR可简单和高灵敏度地鉴定所关注的突变，该探针组包括检测探针和反向探针(counter probe)，其中检测探针由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸具有：包括在所述靶核酸中的所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包括所关注的核苷酸；或与所述核苷酸互补的核苷酸序列；所述寡核苷酸具有附着到5’端的荧光物质和附着到3’端的猝灭剂；所述反向探针由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸具有：包括所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包括不同于所关注的核苷酸的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且其中所述检测探针具有引入的修饰使得其解链温度比反向探针的解链温度高不小于3℃。

此外，本发明人发现，通过设计用于鉴定突变型病毒的探针组，可鉴定具有突变例如抗药性突变的病毒，并且因此，可以确定抗病毒药物的给药方针，从而完成了本发明。

(1)通过荧光实时PCR鉴定靶核酸的突变位点处的核苷酸类型的探针组，所述探针组包括：

由寡核苷酸组成的检测探针，所述寡核苷酸具有：在所述靶核酸中包括所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包括所关注的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列；所述寡核苷酸具有附着到5’端的荧光物质和附着到3’端的猝灭剂；和

由寡核苷酸组成的反向探针，所述寡核苷酸具有：包括所述突变位点的核苷酸序列，所述突变位点包括与所述所关注的核苷酸不同的核苷酸；或与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列，和

其中所述检测探针具有引入的修饰，从而使其解链温度比反向探针的解链温度高不小于3℃。

(2)根据(1)的探针组，其中所述修饰是通过锁核酸的修饰。

(3)根据(1)或(2)的探针组，其中所述靶核酸源自病毒。

(4)根据(3)的探针组，其中所述病毒是丙型肝炎病毒。