[发明专利]使用化学控制的氧化还原态重折叠蛋白质

说明书

本申请要求2009年6月22日提交的美国临时申请第61/219,257号的权益，其通过引用并入本文。

发明领域

本发明通常涉及将高浓度的蛋白重折叠，以及更特别地将在一定体积中2.0g/L及更高的浓度的蛋白重折叠。

发明背景

重组蛋白可在许多种表达系统中表达，包括非哺乳动物细胞，例如细菌和酵母。与重组蛋白在原核细胞例如细菌中的表达有关的一个难题是所表达的蛋白以通常被称作包涵体的有限溶解度的细胞内沉淀物沉淀。包涵体作为细菌宿主细胞在高水平表达时不能正确折叠重组蛋白的结果并作为蛋白变得不能溶解的后果而形成。这尤其符合真核来源的大的、复杂的或蛋白序列的原核表达。不正确折叠的重组蛋白的形成在某种程度上限制了细菌性发酵以高水平的效率生产重组的大的复杂蛋白的商业应用。

自以商业上可行的水平在非哺乳动物表达系统例如细菌中重组表达蛋白的出现以来，不同的方法已经被开发用于从细菌包涵体获得正确折叠的蛋白。这些方法通常遵循以下程序：表达通常以包涵体沉淀的蛋白、裂解细胞、收集包涵体然后将包涵体溶解在包含变性剂或表面活性剂以及任选还原剂的增溶缓冲液中，所述增溶缓冲液展开蛋白并且将包涵体分解为几乎没有结构的单独的蛋白链。随后，将蛋白链用帮助向生物学活性形式复性的重折叠缓冲液稀释或洗涤。当半胱氨酸残基在蛋白的一级氨基酸序列中存在时，其常常需要在允许正确形成二硫键的环境(例如氧化还原系统)中完成重折叠。

复杂分子(例如包含两个或更多个二硫键的分子)的典型重折叠浓度小于2.0g/L，以及更通常地为0.01-0.5g/L(Rudolph和Lilie，(1996)FASEB J.10：49-56)。因此，由于以这些通常的产物浓度重折叠蛋白所需要的大体积，故以工业生产规模将大量的复杂蛋白例如抗体、肽体(peptibody)或其他Fc融合蛋白重折叠具有显著的局限性，并且是面对工业时的常见问题。限制这些类型的蛋白的重折叠浓度的一个因素是不正确配对的二硫键的形成，这可反过来增加那些形式的蛋白聚集的倾向。由于以工业规模的蛋白生产运作时涉及大量材料和大的池尺寸，大量时间以及资源可通过将工艺中的一个或多个步骤排除或简化来节省。

尽管之前已经表明在较高浓度下的蛋白重折叠，但是被重折叠的蛋白是分子量上显著较小的、仅包含一个或两个二硫键的较不复杂的分子中的任一种(参见例如Creighton，(1974)J.MoI.Biol.87：563-577)。此外，这类蛋白的重折叠方法利用基于洗涤剂的重折叠化学(参见例如等人(1997)Eur J Biochem 248：684-691)或利用高压折叠策略(St John等人，(2001)J.Biol.Chem.276(50)：46856-63)。更复杂的分子例如抗体、肽体和其他大蛋白通常并不顺从洗涤剂重折叠条件并且通常在离液序列高的重折叠溶液中重折叠。这些更复杂的分子通常具有多于两个的二硫键，通常在8和24个二硫键之间，并且可以是形成同二聚体或异二聚体的多链蛋白。

在本公开内容之前，这些类型的复杂分子都不能在高浓度(即2.0g/L以及更高的浓度)和以对小规模(并且特别不是在工业规模上)来说有任何有意义的效率程度被重折叠。相反，本文公开的方法可以高浓度在小或大(例如工业)的规模上进行以提供正确重折叠的复杂蛋白。以高浓度和大规模重折叠蛋白的能力不仅可转化为重折叠操作自身增加的效率，而且还代表通过排除对另外的设备和人力的需要而节省的时间和成本。因此，重折叠以高浓度存在的蛋白的方法可转化为对蛋白生产工艺来说较高的效率和成本节省。

附图简述

图1是描述巯基对比率和氧化还原缓冲强度对产物物类(species)分布的影响的一系列曲线图；图1a描述5mM缓冲强度的影响；图1b描述7.5mM缓冲强度的影响；图1c描述10mM缓冲强度的影响；图1d描述12.5mM缓冲强度的影响；图1e描述15mM缓冲强度的影响；图1f描述20mM缓冲强度的影响。

图2是描述在固定的巯基对比率和巯基对缓冲强度下通气的程度对物类分布的影响的一系列曲线图。

图3是以6g/L进行并且使用在1L和2000L进行的所述方法的实施方案最优化的化学控制的非需氧重折叠的分析叠加。

发明概述