[发明专利]利用药物分子伴侣改善生物制剂的生产和纯化

说明书

本申请要求了于2009年5月26日提交的美国临时申请号61/181,255的权益并且通过引用以其整体结合在此。

1.技术领域

本发明通过使用用于重组蛋白质的药物分子伴侣，提供了用于改善重组蛋白质生产的方法。将一种药物分子伴侣结合到由细胞表达的一种重组蛋白质上能够稳定该蛋白质并且增加了该蛋白质到该细胞的内质网外部的输出，并且增加了该蛋白质由该细胞的分泌。

2.背景技术

使用哺乳动物细胞培养系统生产了各种重组人类蛋白质，这些哺乳动物细胞培养系统将这些生物制剂过量表达并且分泌到培养基中，然后通过色谱过程进行纯化。这些成功生产的重组蛋白质包含分泌性蛋白(例如：血液凝固因子、免疫球蛋白、促红细胞生成素和其他的激素，弹性蛋白酶抑制剂等等)和溶酶体酶(例如：β-葡糖脑苷脂酶、α-半乳糖苷酶A，酸α-葡萄糖苷酶等等)。在这样一个生产过程中几个关键性因素会影响效率和产量：对于细胞系的表达水平；所分泌的重组蛋白质是否在纯化之前在该细胞培养基中维持了其生物活性；以及用于回收该生物制剂的蛋白质纯化方案。

上述的实例是在内质网(ER)处都共用一种生物合成途径的蛋白质(Blobel et al.，1979)。这些蛋白质(包含全部膜蛋白、分泌性蛋白、过氧化物酶体以及溶酶体蛋白)还共用一种到内质网外部的共同的输出途径，内质网将这些新合成的蛋白质运输到高尔基体用于附加的翻译后修饰以对这些不同种类的蛋白质进行分类，以便它们到达它们预期的细胞或细胞外的目的地(Kornfeld，1987)。为了使这些蛋白质到达它们最终的目的地，它们必须首先折叠成稳定的结构，这些结构在离开此区室之前能充分地经过ER质量控制(QC)系统(Ellgaard & Helenius，2003)。突变体蛋白质通常不会稳定地折叠并且它们被ER QC系统识别并且被保留(Ellgaard & Helenius，2003)。如果在多次尝试后这些突变体蛋白质未能达到一种稳定构象，它们最终会被ER相关的降解(ERAD)系统清除。较不稳定的突变体蛋白质的异常ER截留和过度的ERAD显示为众多疾病的主要原因，这些疾病包括囊性纤维病、2型糖尿病以及各种溶酶体贮存病(Schmitz et al.，2005；Fan et al.，1999；Tropak et al.，2004)。

一些正常蛋白质过早的降解也被观察到，这样使得野生型蛋白质的一个可观察部分在规定的时间范围内未能达到稳定构象并且最终被ERAD清除。引用最多的实例是50％-70％的野生型囊性纤维病跨膜传导调节蛋白(CFTR)氯根离子通道的清除。人们相信大的、复杂的蛋白质(例如：CFTR、受体、凝固因子等等)比更小的、简单的对应物更容易进行低效率的折叠并且因此更易于过早的降解。此外，Randall Kaufman及其同事们描述了重组人类因子VIII的积聚和内质网的异常溶胀、某种激酶的急性活化以及在此生物制剂的生产过程中的各种细胞途径。现在这些深奥的细胞效应作为与复杂蛋白质以及其他有问题的蛋白质的表达相关联的ER应激是已知的(例如：因子VIII以及Z-型α-1抗胰蛋白酶)。人们还相信蛋白质积聚、过度的降解以及ER应激对重组蛋白质生产有不利影响并且导致了较低的蛋白质产率。因此对改进重组蛋白质的生产工艺存在着需求。

3.发明内容

本发明通过使用用于重组蛋白质的药物分子伴侣(还被称为活性位点特异性分子伴侣；ASSC)提供了用于改善重组蛋白质生产的一种方法。根据本发明，一种重组蛋白质(例如：酸α-葡萄糖苷酶、酸α-半乳糖苷酶A或酸β-葡萄糖苷酶)的生产可以被改进，例如通过将一种药物分子伴侣(例如：1-脱氧野尻霉素(1-deoxynorjirimycin)、1-脱氧半乳糖野尻霉素(1-deoxygalactonorjirimycin)或异桑叶生物碱)结合到一种宿主细胞中表达的一种重组蛋白质上。

在一个非限制性实施方案中，通过在体外的一种细胞系表达了该重组蛋白质。在另一个非限制性实施方案中，该宿主细胞是一种哺乳动物细胞。在另一个非限制性实施方案中，该宿主细胞可以是一种CHO细胞、HeLa细胞、HEK-293细胞、293T细胞、COS细胞、COS-7细胞、小鼠原代成肌细胞(mouse primary myoblast)或NIH 3T3细胞。

在另一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣与该重组蛋白质的结合增加了该蛋白质到细胞的内质网外部的输出。

在另一个非限制性实施方案中，该药物分子伴侣到该重组蛋白质的结合增加了该蛋白质由细胞的分泌。