[发明专利]重组草酸盐降解酶的纯化和分离以及含有草酸盐降解酶的喷雾干燥粒子

说明书

发明领域

本发明涉及包含减少草酸盐的酶的喷雾干燥的粒子，所述粒子用于将活性形式的酶递送至胃，减少草酸盐的酶在那里发挥其作用。因而，本发明提供了用于减少胃中的草酸盐的手段。此外，本发明涉及分离重组蛋白的方法，所述重组蛋白在宿主细胞的细胞质中不溶，并且不作为被视为无活性、错误折叠的蛋白沉淀物的包含体存在，所述方法包含：

a)将不作为包含体存在的不溶性重组蛋白与可溶性宿主细胞蛋白分离开；以及

b)溶解分离的重组蛋白。

发明背景

肾/尿路结石疾病(尿石症)是世界范围内的主要健康问题。大多数与尿石症相关的结石由单独的草酸钙组成，或由草酸钙加磷酸钙组成。其他疾病状态也与过量草酸盐有关。他们包括外阴痛、与终末期肾病相关的草酸盐沉着症、心脏传导障碍、克罗恩病(Crohn’s disease)以及其他肠道疾病状态。

草酸和/或其盐、即草酸盐，发现于各种不同食物中，并因而是人类和动物膳食中许多组分的成分。在食用了含有增加量草酸的食物后可能会发生草酸盐吸收增加。众所周知，诸如菠菜和大黄的食物含有大量草酸盐，但是大量其他食物和饮料也含有草酸盐。因为草酸盐存在于如此多样的食物中，因此草酸盐含量低并且同时也可口的食物难以配制出来。此外，依从低草酸盐的膳食常常也是成问题的。

形成肾结石的风险围绕着大量尚未完全理解的因素。在西方国家中，在多达12％的人群中发生肾或尿路结石疾病，并且这些结石中约70％由草酸钙或草酸钙加磷酸钙组成。一些个体(例如患有诸如克罗恩病、炎性肠病或脂肪痢的肠道疾病的患者，以及已经历空肠回肠绕道术的患者)在其膳食中吸收了比其他个体更多的草酸盐。对于这些个体来说，草酸盐尿石症的发病率显著增加。发病率的增加是由于肾脏和尿液中草酸盐水平的增加，并且这种在人类中最常见的高草酸盐尿综合征被称为肠原性高草酸盐尿。在患有终末期肾病的患者中草酸盐也是问题，并且近来有证据表明尿液草酸盐升高也涉及到外阴前庭炎(外阴痛)。

已经建议将包含减少草酸盐的细菌的肠溶包衣的或其他组合物，用于在通过肠道期间在被系统吸收之前降低草酸盐浓度。肠溶包衣组合物以完整形式通过胃，即包衣是完整的，因此不在胃中降解草酸盐。更好的方法是在草酸盐在肠道中被吸收之前，在胃中减少草酸盐。因此，对于开发能够减少胃中的草酸盐以便减少例如膳食草酸盐的组合物，存在着需求。此外，这样的组合物适用于治疗肠原性和吸收性高草酸盐尿，例如引起复发性结石病的高草酸盐尿。这种治疗的目的是使患者具有正常或至少降低的尿液草酸盐水平。

发明概述

本发明涉及包含草酸盐降解酶的喷雾干燥的粒子。喷雾干燥的粒子适用于药物和/或食品组合物，用于将活性形式的酶递送至胃并在胃中降解草酸盐。因此，本发明还提供了通过给药喷雾干燥的粒子或包含它们的组合物来治疗和预防草酸盐相关病症的方法。

本发明还提供了用于分离和纯化在宿主细胞的细胞质中不溶或仅仅微溶、并且不作为宿主细胞的包含体存在的重组蛋白的方法。重组蛋白尤其是重组的草酸盐降解酶。

附图说明

图1是通过分段梯度盐洗脱从苯基-琼脂糖凝胶柱洗脱的野生型OxDC的色谱图。峰1和峰2都含有OxDC，但是峰1含有80-90％的OxDC，具有较高比活性(50-60U/mg纯OxDC)，而峰2含有30-70％的OxDC，具有较低比活性(30-50U/mg纯OxDC)。峰2中的OxDC据推理是受损或不正确折叠的。峰3是杂质(峰1-3在虚线曲线上标出)。不同曲线用点、三角形、正方形、菱形和十字标出。

图2是显示喂食0mg草酸盐(基线，无ox)、2.3％草酸钾(HOD)和联合的本发明的草酸脱羧酶粒子(Oxazyme)与2.3％草酸钾的大鼠的草酸盐平均尿液排泄的图。尿液草酸盐针对肌酸酐进行归一化，并且其是从第4至9日收集的累积尿液。Ox/Cr是草酸盐/肌酸酐。发明详述

正如上面显示的，本发明提供了：

i)用于分离和纯化重组蛋白、尤其是草酸盐降解酶的方法，

ii)包含一种或多种草酸盐降解酶的喷雾干燥的粒子，以及

iii)包含这样的粒子的组合物。