[发明专利]新的血红蛋白及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及可用作细胞培养物、器官保存溶液和血液代用品的新的分离的血红蛋白。

背景技术

本发明涉及血红蛋白及其以简单氧分压固定、携带和释放氧的性质。这种血红蛋白的一种特别的优点是其用作工业和治疗学应用中的氧载体。目前存在两种可行的氧疗法：基于血红蛋白的氧载体(HBOC)和全氟化碳(PFC)。直接从红血球中获得的血红蛋白不能用作血管内的氧载体。为了避免血红蛋白的自发破裂和从红血球提取的血红蛋白的毒性，基于血红蛋白的氧载体使用纯化的人血红蛋白(Riess等人Chem Rev 2001，101：2797)、动物(牛)血红蛋白(Lok等人Nature 2001，410：855)或重组(Looker等人Nature 1992，356：258)血红蛋白作为原料。然后纯化的血红蛋白的各链与其他球蛋白链共价桥接或用微囊包封。全氟化碳是能溶解大量氧然后递送所述氧的液体氟化烃化合物。然而，在这种情况下氧分压必须高于空气氧分压。

出于以下两种主要目的来开发氧疗：i)它们可以作为输血的备选方案，从而避免、减少或延迟异体血的输送，和ii)改善供血差的器官的组织氧化。本发明人之前已经表明，多毛纲环节动物沙蠋(Arenicola marina)的胞外聚合的血红蛋白可用作氧疗法(Rousselot等人2006 Biotech Journal 1：333)。所述血红蛋白可容易地获得并可纯化为避免昂贵合成步骤的均质产物。其也易于贮存且很少会引起免疫原性应答，因为如已经证实的，其不是糖基化的。Zal等人已经提出了来自沙蠋的这种胞外血红蛋白的四级结构模型(Zal等人Eur.J.Biochem 1997，243：85)。该研究表明存在十个亚基：其中八个是球蛋白，包括两个单体(M＝～15kDa)和两个由五个二硫键结合的三聚体(T＝～49kDa)。其余两条链对应于接头链(L)，它们是二硫键结合的，以形成同种或异种二聚物(～50kDa)。这两个单体亚基中的每一个的三个和六个拷贝与三聚体的一个拷贝形成十二聚体亚基(D)，其平均质量接近于200kDa。十二个球蛋白链的这种复合物通过42个接头链连接在一起，总质量达到3648±24kDa。

当研究另一科的多毛纲环节动物时，本发明人从沙蚕科(Nereididae family)中分离出一种新的血红蛋白，其具有在若干介质中长期保持稳定性和功能性的优点。属于沙蚕科的蠕虫在从其系统发育开始的若干方面与属于沙蠋科的蠕虫不同。从进化观点来看，这两科从几百万年前就彼此有差异(Halanych和Janosik，2006)。此外，这两种环节动物科不具有相同的形态、相同的特性、相同的基因、相同的生理机能，也不具有相同的有机体生物学。例如，沙蚕科是漂浮(errant)物种，而相比较，沙蠋属蠕虫生活在潮间区(intertidal area)上的沙廊道中。此外，沙蠋科在其寿命期间再生若干次，而沙蚕科一年再生一次并在再生期后死亡。

然后本发明人发现，来自沙蚕科的新的分离的血红蛋白可用作若干应用(特别是用于细胞培养基补充剂)的氧载体、用作器官保存溶液的添加剂或用作用于输送的人造氧载体。

发明简述

本发明的一个目的是来自属于沙蚕科的蠕虫的分离的血红蛋白或其部分，具有：

-6-7℃下的P50为5到15、优选9到12mm Hg，16-17℃下的P50为12到20、优选15到18mm Hg，且36-37℃下的P50为20到50、优选30到44mm Hg，

-优选不含游离半胱氨酸，

-优选未糖基化。

在本发明的一个实施方式中，所述血红蛋白从沙蚕Nereis virens中分离，Nereis virens也称为Nereis diversicola、Neanthes virens或Hediste diversicolor(虽然这些学名是不同的，它们指相同的种)或该种的其他同义术语。

在另一个实施方式中，所述血红蛋白为水溶液、冷冻溶液、解冻溶液或冻干粉末形式。

本发明的另一个目标是含有上述血红蛋白的小袋。本发明的血红蛋白可用作血液代用品。在这种情况下，所述血红蛋白存在于生理学可接受的介质中。“生理学可接受的介质”是指与进入活人血液的体内注射相容的介质。然后所述生理学可接受的介质与人血相容，其不引起任何有害事件并保持本发明血红蛋白的活性。所述血液代用品可存在于任何容器中，例如小袋、瓶子、烧瓶、袋中...所述血红蛋白可以是水溶液、冷冻溶液、解冻溶液或冻干粉末形式。

本发明的另一个目的是含有上述血红蛋白的细胞培养基。