[发明专利]脱氢酶或对应的底物的测定方法及测定用试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明涉及测定样品中的脱氢酶或对应的底物的方法及其中使用的试剂盒。

【背景技术】

在血清、血浆等的样品中，存在高浓度的脱氢酶或对应的底物。在临床化学诊断中，为了测定它们，作为辅酶而一般使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。作为这样的方法中使用的脱氢酶和底物的组合，已知乳酸脱氢酶和乳酸、谷氨酸脱氢酶和谷氨酸、醇脱氢酶和醇、甘油-3-磷酸脱氢酶和甘油-3-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸等。此时，为了测定该组合之任何一方，将其他一方与辅酶一同作为试剂使用。另外，与其同样地，为了测定样品中的尿素等的特定物质，通过使特定物质与试剂进行酶反应而作为中间体或最终产物生成特定的脱氢酶或对应的底物，使该脱氢酶或对应的底物与上述辅酶一同反应，结果测定特定物质也广泛进行。

在这些的测定方法中，最终一般采用将NAD或NADP通过脱氢酶反应变换为作为还原型的NADH或NADPH，而基于其结果发生的紫外线波长域(通常、340nm)中的吸光度的升高来测定脱氢酶或对应的底物的方法。但是，此时，为了在紫外线区域测定，有作为测定池不使用简便的玻璃或塑料而使用高价的石英的必要，而且有作为分析装置而使用紫外线光源或检测装置的必要，因此，有分析装置易变得大型且高价的倾向。其结果，不可在干燥化学领域或小的医院也可测定的使用可视分光光度计的装置中适用。从而，为了可在那样的场合中使用，期望在可视部测定上述的脱氢酶或对应的底物的方法。

另一方面，在专利文献1中提案，使葡萄糖-6-磷酸与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应之时，作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP和NADH或NADPH的组合，进行酶循环反应，将生成的作为还原型酶的硫代NADH或硫代NADPH基于在400nm附近的可视部的吸光度而测定葡萄糖-6-磷酸的方法。但是，此方法使用酶循环反应，不好说必定是简便的测定方法，另外不好说是在测定高浓度的测定对象物中适宜的测定方法。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：特开平4-335898号公报

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明的课题在于提供，使基于在可视部的吸光度的测定成为可能，可在干燥化学领域或小的医院也可测定的使用可视分光光度计的装置中适用，并且，正确地测定以高浓度存在于样品中的脱氢酶或对应的底物的方法。

【解决课题的技术方案】

本发明人着眼于为了如例如专利文献1所述，通过酶循环法测定低浓度的脱氢酶或对应的底物而使用的辅酶硫代NAD或硫代NADP通过酶反应而使可视部的吸光度变化，对于使用该辅酶，测定在样品中以高浓度存在的测定对象的方法进行检查。其结果，将高浓度的测定对象作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP时，难以在高浓度区域维持直线性，而且空白也有升高的时候，判明不可正确地测定测定对象。

本发明人尝试了，为了将样品中的某种物质用某酶除去，通过作为辅酶而使用NAD来进行酶反应，接下来，使用除去该物质的样品而使脱氢酶、对应的底物及硫代NAD反应来测定可视部区域的吸光度，从而测定样品中的脱氢酶或其对应的底物。然而，通过无关于NAD和硫代NAD的添加的顺序，以使样品与脱氢酶、对应的底物、硫代NAD及NAD共存的单纯的构成测定可视部区域的吸光度，令人惊讶地发现，反应空白减少，标准曲线的斜率变小，可正确地测定样品中的脱氢酶或其对应的底物。其结果判明，通过这样的构成，解决了上述的问题，在高浓度区域也可正确地测定脱氢酶或对应的底物。

从而，在以可视部的吸光度测定样品中含的脱氢酶或对应的底物的方法中，通过作为辅酶而，使用硫代NAD或硫代NADP以及NAD或NADP的二者，从而测定对象在高浓度区域也可维持直线性，并且，可使标准曲线的空白变小，其结果，发现可用简便的可视分光光度计在测定对象浓度的宽广的区域提供简单并且正确地测定脱氢酶或对应的底物的方法，从而完成本发明。

从而，本发明涉及使用脱氢酶、对应的底物及辅酶进行反应而测定样品中的该脱氢酶或对应的底物的测定方法，所述方法包括：作为辅酶而使用硫代NAD或硫代NADP及NAD或NADP进行反应，以及测定源于生成的硫代NADH或硫代NADPH的吸光度的增加。