[发明专利]获得肌成纤维细胞的方法

说明书

本发明涉及获得肌成纤维细胞的方法。

在下面的说明书中，方括号([])中的参考文献是指在文本的末端所给出的参考文献的列表。

肌成纤维细胞代表称为CAF、“与癌相关的成纤维细胞”(换而言之与癌相关联的成纤维细胞)的特定类型的成纤维细胞。其还牵涉在各种生物过程，比如例如组织的重构中。

其表达平滑肌α-肌动蛋白或SMA标志物。

在下文中，术语成纤维细胞是在广义上使用。它不仅将这里“严格意义上”称为成纤维细胞的成纤维细胞归在一起，而且还将成纤维细胞的衍生物比如激活的成纤维细胞、CAF及肌成纤维细胞也归在了一起。因此，包括肿瘤性过程中牵涉的成纤维细胞，还包括其中涉及肌成纤维细胞的任何其它生物过程中牵涉的那些成纤维细胞。

尤其，通过肿瘤的酶消化，不论是否接着一个或多于一个的纯化步骤，从肿瘤获取成纤维细胞是已知的(Orimo等，Cell 2005，121：335-348[1]或Allinen等，Cancer Cell 2004，6：17-32[2])。

迄今，成纤维细胞的培养物已经在含血清的培养基(通常5-20％血清)中获得，且培养物含有可变百分比的肌成纤维细胞。

例如，在含有5％血清的培养基中的CAF(Asterand)可从市场上购得，比如其通过简单的目视检查来确定。

学术实验室在含有10％血清的培养基中生产出了CAF的群体。通过平滑肌α-肌动蛋白标志物的测量来确定这些细胞的表型。因此，这些群体含有可变百分比的CAF，最多平均30％。

从市场上还可购得在含有20％血清的培养基中的人肝脏肌成纤维细胞(Dominion Pharmakine)，只有50-60％的肌成纤维细胞表达平滑肌α-肌动蛋白(SMA)标志物。在肝脏中及也在胰腺中，衍生肌成纤维细胞的细胞是星状细胞，其具有在培养时表现出自发激活SMA标志物的表达的特定性质(Kinnman等，Lab Invest 2001，81：1709-1716[3]；Omary等，JCI 2007，117：50-59[4])。

然而，血清例如胎牛血清或新生小牛血清的使用具有以下缺点：

-与血清的收集有关的伦理问题，

-血清是组成可变的生物学液体，

-血清的确切组成是未知的，不可能准确地确定细胞的需求，

-血清含有可干扰在制药工业中对培养中的细胞使用的测试的因子(生长因子，拮抗剂等)，

-当血清从培养基中省去时，适应了在血清中生长的细胞改变表型或死亡。

简而言之，迄今已知且在体外研究的从病理组织中分离的成纤维细胞的群体：

-是异质的，

-含有可变百分比的肌成纤维细胞，及

-在含有血清的培养基中生长，血清的存在具有上述的缺点。

在本文中，本发明所解决的主要目的是获得肌成纤维细胞的群体，其特征在于便于这些细胞的任何研究，及尤其是获得尽可能纯的肌成纤维细胞群体。

出于该目的，本发明涉及获得肌成纤维细胞的方法，特征在于：

(a)制备基本上包括成纤维细胞的细胞样品；及

(b)将所述细胞样品在无血清的培养基中培养。

基本上包括成纤维细胞的细胞样品表示其包含的细胞至少50％是成纤维细胞，优选地至少70％。无论如何，本领域的技术人员将知道如何通过常规实验评价对于本发明的实施细胞样品必须包含的成纤维细胞的百分比。

本发明具有生产比现有技术的那些更纯的肌成纤维细胞的群体且该群体生长在不含血清的培养基中的优势。

因此，通过根据本发明的方法所获得的肌成纤维细胞使得例如准确地且可重现性地研究这些细胞的生物学并鉴定潜在的治疗靶标成为可能。

由于缺少血清，其还使得研究细胞的需求及确定因子成为可能，例如诱导其分化、使其能维持其表型、保持其增殖和/或牵涉在这些细胞的过早衰老中的因子。

在无血清的培养基中一代或两代后，用根据本发明的方法所获得的肌成纤维细胞的群体可总共达到多于95％的肌成纤维细胞。

无血清的培养基优选地包括为用于上皮细胞的培养基的无血清基础培养基。事实上，从这样的基础培养基所获得的培养基使得获得生长良好的肌成纤维细胞成为可能。

这一无血清基础培养基尤其可以是用于人乳腺上皮细胞的培养基。选择性地，例如，这可以是已知用于支气管、胎盘或肾脏上皮细胞的培养的无血清培养基。