[发明专利]发酵方法

权利要求书

1.培养原核生物宿主细胞的方法，其中将原核生物宿主细胞用表达载体转化，所述表达载体包含可操作地连接到包含编码多肽的核酸序列的转录单元的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操纵子的诱导型启动子，

其中诱导型启动子的诱导物是能诱导启动子的甘露糖或其衍生物，

其中，

在第1步骤中，将原核生物宿主细胞在不同于诱导物的第1碳源的存在下培养，且

在第2步骤中，将原核生物宿主细胞在所述诱导物的存在下培养。

2.权利要求1的方法，其中诱导物的添加在培养达到测定参数之后开始。

3.权利要求1或2的方法，其中测定参数是选自光密度(OD)和碳源浓度的至少一种。

4.权利要求3的方法，其中测定参数是在600nm处的光密度。

5.前述权利要求中任一项的方法，其中方法是补料分批方法。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中经时连续添加全部或部分诱导物。

7.权利要求1～6中任一项的方法，其中以一份加入至少部分诱导物。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中以经时指数地增加的速度加入至少部分诱导物。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中在诱导物的首次添加之后，在培养达到第2测定参数之后，又添加至少一次诱导物。

10.权利要求9的方法，其中第2测定参数选自光密度OD，溶液中的诱导物浓度，产生的多肽浓度或宿主细胞中包含的报告基因的信号强度。

11.权利要求1～10中任一项的方法，其中启动子选自manP启动子和manR启动子

12.权利要求1～11中任一项的方法，其中将第1碳源和诱导物的混合物补给发酵培养基，其中第1碳源与诱导物的比是3∶1至1∶3。

13.前述权利要求中任一项的方法，其中载体包含调控基因manR的完全或部分序列。

14.前述权利要求中任一项的方法，其中载体包含选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的序列，与它们互补的序列或其变体。

15.前述权利要求中任一项的方法，其中不同于诱导物的碳源是葡萄糖。

16.前述权利要求中任一项的方法，其中编码多肽的核酸序列是异源核酸序列。

17.在原核生物宿主细胞中产生多肽的方法，其包括下列步骤：

构建在原核生物宿主细胞中可表达的载体，所述载体包含可操作地连接到包含编码多肽的核酸序列的转录单元的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操纵子的诱导型启动子，

将原核生物宿主细胞用所述载体转化，以及

通过在权利要求1～16之任一项中所述的培养条件下培养转化的宿主细胞来使所述多肽表达。

18.权利要求15的方法，其还包括下列步骤：自细胞或自细胞培养物回收多肽。

19.重组体原核生物宿主细胞，其包含表达载体，所述表达载体包含：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露糖操纵子的甘露糖诱导型启动子、或

所述甘露糖操纵子的诱导型启动子的纯化的及分离的核酸序列，

其中所述载体或所述甘露糖操纵子的诱导型启动子的纯化的及分离的核酸序列可操作地连接到包含编码多肽的核酸序列的转录单元。

20.权利要求19的重组体原核生物宿主细胞，

其中甘露糖操纵子的诱导型启动子是根据权利要求11～13中任一项的一种，或者

其中分离的及纯化的核酸是根据权利要求14的一种。

21.重组体原核生物宿主细胞，其中宿主细胞选自硬壁菌门(Firmicutes)。

22.权利要求19～21中任一项的重组体原核生物宿主细胞在权利要求1～18中任一项的方法中的用途。