[发明专利]寡核苷酸探针组以及与其相关的方法和用途

说明书

在第一个方面，本发明涉及寡核苷酸探针组，其包含针对感兴趣的基因组目标序列的至少100种不同的单链寡核苷酸探针，其中每个单独的寡核苷酸包含至少一种标记物。在进一步的方面中，本发明涉及所述寡核苷酸探针组用于检测基因组目标序列的用途。在另一个方面，本发明涉及检测感兴趣的基因组目标序列的方法，所述方法包括在有助于寡核苷酸探针组与感兴趣的基因组目标序列结合的条件下孵育根据本发明的寡核苷酸探针组和样品，并检测寡核苷酸探针与基因组目标序列的结合的步骤。在进一步的方面中，本发明提供了产生针对感兴趣的基因组目标序列的寡核苷酸探针组的方法，所述方法包括设计与感兴趣的基因组目标序列的至少100个不同区域互补的寡核苷酸探针组并合成所述寡核苷酸探针组的步骤。在又进一步的方面中，本发明涉及试剂盒，其包含根据本发明的寡核苷酸探针组，此外，包含选自以下构成的组的进一步的成分：去石蜡化试剂、预处理试剂、洗涤试剂、检测试剂以及产品单。

原位杂交(ISH)已经成为研究和临床诊断学的多个领域中不可缺少的工具。原位杂交(ISH)是一种独特的技术，其中组合了分子生物学和组织化学技术来研究组织切片或细胞学制品中的基因表达，因为它容许在特定细胞中DNA和RNA两者的检测和定位。ISH分析在1969年首次描述，涉及标记的核苷酸探针与互补DNA或RNA之间的杂交反应，其杂交物可以取决于所包括的标记物的性质通过多种操作来检测。在70年代后期非放射性的探针标记和检测系统的引入使得原位杂交分析在诊断病理实验室中作为分子诊断工具成为可能。ISH原位地定位基因序列，使得基因表达的产物可视化，同时保持异质组织内的细胞完整性。ISH方法的主要优点是它对异质组织或细胞群体中单独靶点的特异性，以及在细胞或染色体作图中检测低拷贝基因表达方面的敏感性。ISH由多个步骤组成，包括探针制备和标记、组织制备、杂交以及信号检测(综述参见，例如，Jin et al.，2001，Morphology Methods：Cell and Molecular Biology Techniques：27-46)。

Southern和slot印迹是在乳腺癌样本中使用的第一种基于基因的HER-2检测方法。FISH(荧光原位杂交)技术，其是形态学驱动的并且可以被自动化，如IHC，优点是更为客观的记分系统以及存在内建的内部对照，所述内部对照由样本中所有非赘生性细胞中存在的两种HER-2基因信号组成。FISH测试的缺点包括每次测试的高成本、玻片计分所需的较长的时间、荧光显微镜的需求、不能保存玻片用于保存和复查，以及有时在鉴定侵入性的肿瘤细胞方面。迄今为止，FDA批准了两个版本的ISH分析：Ventana Inform^TM测试，其仅测量HER-2基因拷贝，以及Abbott-Vysis Pathvysion^TM测试，其包括双色形式的染色体17探测，这两种都被描述为是高度相关的(综述参见，例如Ross et al.，2004，Molecular and Cellular Proteomics 3.4：379-398)。

产色的原位杂交方法(也称为CISH技术)特征在于免疫组织化学(即，常规显微镜，低成本)和FISH(即，内建的内部对照、客观记分、更高效的DNA靶向)两者的优点。例如，FISH和CISH方法两者在两个机构的实验室所进行的测试中被用于比较浸润性乳腺癌的31个病例，在26例(84％)中两种方法得到了相同的结果(Gupta et al.，2003，Am.J.Clin.Pathol.，119：381-387)。CISH和IHC检测方法可以组合来提供基因拷贝数和蛋白质表达的同时评估，但是这样的方法尚未在临床实践中采用。

对于原位杂交可以使用三种原理类型的探针，包括(i)双链互补DNA探针，(ii)单链反义RNA探针，和(iii)合成的寡核苷酸探针。如其他的杂交技术一样，探针设计、合成和标记对于原位杂交在特异性和敏感性方面的成功起到关键的作用。标准标记过程一般包括酶催化方法的应用。双链DNA探针可以由酶切口翻译或随机引物方法来标记，反义RNA探针通常是合成的，通过体外转录方法来标记。然而，这些方法引起非限定的探针的产生，其中标记物的位置和数量不是限定的，对于医师是不知道的。此外，酶标记需要更有实验技巧的人来进行这样的标记，因为掺入的标记物的量取决于一系列的变量，包括，例如酶活性和/或存在的标记物的量。最后，对于掺入的标记物的确切位置和量，每种标记可能具有不同的结果，因为标记反应是随机过程的结果。