[发明专利]具有β-葡糖苷酶活性的新蛋白质及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的新蛋白质及其用途，详细地说，涉及来源于解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)的具有β-葡糖苷酶活性的新蛋白质、该蛋白质的类似体和改变体、编码这些蛋白质的多核苷酸、以及这些蛋白质的制造方法和用途。

背景技术

纤维素是高等植物细胞的主要构成成分，广泛地天然存在。纤维素是由葡萄糖通过β-1，4-糖苷键聚合而成的高分子多糖，天然纤维素以结晶状或非结晶状态存在，进一步与其他成分、木质素、半纤维素类、果胶类等复杂地结合而构成植物组织。

纤维素酶是分解纤维素的酶的总称，一般由微生物生产的纤维素酶包含多种纤维素酶成分。纤维素酶成分从其底物特异性方面出发，被分类为纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶3种，在作为产生纤维素酶的丝状菌的黑曲霉(Aspergillus niger)的情况下，认为最多产生4种纤维二糖水解酶、15种内切葡聚糖酶、15种β-葡糖苷酶。认为这些显示各种作用方式的多个酶互补表达协同效果，从而分解作为植物细胞壁的主成分的纤维素。β-葡糖苷酶被认为催化使葡萄糖从纤维寡糖、纤维二糖或与苷元形成β-D-吡喃葡萄糖基结合的配糖体中游离出来的反应，是在纤维素的糖化系的最终阶段和葡萄糖从配糖体的游离中重要的酶。

从生物质转换乙醇具有可能容易获得、能够避免材料的燃烧或地下掩埋、和乙醇燃料清洁等优点。木材、农业残留物、草本性作物和都市的固体状垃圾作为乙醇制造用生物质被关注。这些材料主要包含纤维素、半纤维素和木质素。一旦纤维素被转化为葡萄糖，葡萄糖就容易地被酵母发酵成乙醇。另一方面，纤维二糖不会容易地被酵母发酵成乙醇，残留的纤维二糖造成乙醇收量的降低。更重要的是，纤维二糖对内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶来说是强的抑制剂。因此水解中的纤维二糖的积累对于乙醇制造是不优选的。由于纤维素酶产生微生物一般基本不产生β-葡糖苷酶，因而在酶的水解中发生的纤维二糖的积累成为主要问题。

为了促进从纤维二糖向葡萄糖的转化，在宿主中过量表达β-葡糖苷酶、增加β-葡糖苷酶的收量是促进从生物质向葡萄糖的糖化的有效方法。因此，期望用与导入纤维素酶产生微生物并表达的、新的β-葡糖苷酶基因的分离。

另一方面，关于丝状菌解纤维顶孢霉，已经报告了其生产糖化力强的纤维素酶(非专利文献1)，在饲料用途和/或青贮料用途中具有高有用性(专利文献1-3)。另外，关于所含有的纤维素酶成分(专利文献4-10)也进行了详细研究，明确了其与其他丝状菌同样地分泌多种纤维素酶成分。特别是关于纤维素酶中的β-葡糖苷酶活性，报告了活性显著高于里氏木霉(Trichoderma reesei)等的纤维素酶(专利文献11)。从这样的特性出发，作为分离β-葡糖苷酶基因的对象，解纤维顶孢霉受到关注。

然而，到目前为止从解纤维顶孢霉分离出的基因还很少(专利文献9、10)，而且对于分离出的基因，到目前为止还没有成功地在除解纤维顶孢霉以外的丝状菌中表达。

专利文献1：日本特开平7-264994号公报

专利文献2：日本特许第2531595号说明书

专利文献3：日本特开平7-236431号公报

专利文献4：日本特开2001-17180号公报

专利文献5：国际公开97/33982号小册子

专利文献6：国际公开99/011767号小册子

专利文献7：日本特开2000/69978号公报

专利文献8：日本特开平10-066569号公报

专利文献9：日本特开2002/101876号公报

专利文献10：国际公开2002/026979号小册子

专利文献11：日本特公昭60-43954号公报

非专利文献1：“アグリカルチユラル·アンド·バイオロジカル·ケミストリ一(Agricultural and Biological Chemistry)”，(日本)，1987年，第51卷，第65页

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于这样的状况而做出的，其目标在于从解纤维顶孢霉中分离新的β-葡糖苷酶基因。本发明的进一步目标在于使分离出的β-葡糖苷酶基因在宿主中高表达，增加从宿主的β-葡糖苷酶的收量。

用于解决课题的方法