[发明专利]用于抛物线状曲线的PCR的肘值的确定

说明书

技术领域

本发明总体上涉及用于处理聚合酶链式反应(PCR)数据的系统和方法，并且更特别地涉及用于确定PCR放大曲线中的特性循环阈值(Ct)或肘值、或具有抛物线形状的其它生长曲线中的肘值的系统和方法。

背景技术

聚合酶链式反应是用于对定义核酸序列进行酶合成或放大的体外方法。该反应通常使用两个低聚核苷酸引物，其混合成相反的股并且位于将被放大的模板或目标DNA序列之侧。引物的延伸物被热稳定的DNA聚合酶催化。涉及模板变性、引物退火和由聚合酶进行的退火引物的扩展的重复循环系列导致特定DNA片段的指数积累。在该过程中通常使用荧光探针或标记以促进放大过程的检测和量化。

特别地，均质且不要求在放大的开始或反应的物理采样之后添加试剂以进行分析的荧光技术是吸引人的。示例性均质技术使用低聚核苷酸引物来对感兴趣区域和荧光标签或染料进行定位以进行信号生成。基于PCR的典型方法使用具有两个相交互发色团的FRET低聚核苷酸探针(相邻混合探针、TaqMan探针、分子信标(Molecular Beacon)、Scorpion)具有仅一个荧光团的单低聚核苷酸探针(G退火探针、Crockett，A.O.和C.T.Wittwer，Anal.Biochem.2001；290：89～97和SimpleProbe，Idaho Technology)以及使用dsDNA染料(例如SYBR绿色I)来代替共价的荧光标记低聚核苷酸探针的技术。结合到PCR中的所有双股(ds)DNA的DNA结合染料在结合时引起染料的荧光。因此，PCR期间的DNA产物的增加因此导致荧光强度的增加，并在每个循环进行测量，从而允许将DNA浓度量化。然而，潜在的缺点是到所有dsDNA PCR产品的非特定绑定，影响精确的量化。参考标准稀释，能够确定RCR中的dsDNA浓度。

荧光报告探针仅检测特定探针被绑定到的DNA序列，并因此显著地增加特殊性。这即使在存在非特定DNA扩增的情况下，也允许进行扩增的量化。为了同一反应中的多个靶的检测，可以在多重试验中使用荧光探针，其中，对每个靶使用具有不同色彩的标签的特定探针。荧光报告探针的特殊性还防止由引物二聚体引起的测量干扰，其是扩增期间的不期望的副产物。大多数应用是基于荧光报告化合物与被绑定到探针的荧光的猝灭剂之间的相互作用。只要报告和猝灭剂化合物非常接近，则可以在用激励源(例如激光器、LED等)进行激励时仅检测基本荧光。一旦发生扩增，则报告和淬灭剂化合物的相互作用被破坏，导致可检测的荧光信号。在每个PCR循环处扩增的产物的增加引起由于报告和淬灭剂化合物的减少的相互作用而导致的荧光的成比例增加。通常，在每个扩增循环中检测并测量荧光，并且使用与产物的指数式增加相对应的其几何增加来确定每个反应中的阈值循环(CT)。

在图1中示出了典型的实时PCR曲线(实线)，其中，对比用于典型PCR过程的循环数目对荧光强度值进行绘图。在这种情况下，在PCR过程的每个循环中监视PCR产物的形成。通常在热循环仪中测量扩增，其包括用于测量扩增反应期间的荧光信号的部件和器件。此类热循环仪的示例是Roche Diagnostics LightCycler(商品目录号No.20110468)。例如借助于荧光标签混合探针来检测扩增产物，其仅在其被绑定到靶核酸时发射荧光信号，或者在某些情况下还借助于绑定到双股DNA的荧光染料。

对于典型PCR曲线而言，识别基线区域的末端处的转折点(其通常被称为肘值或循环阈值(Ct)值)对理解PCR扩增过程的特性极其有用。可以使用Ct值作为PCR过程的效率的度量。例如，通常针对要分析的所有反应来确定定义的信号阈值，并针对靶核酸以及针对诸如标准或管家基因的基准核酸来确定达到此阈值值所需的循环数目(Ct)。可以基于针对靶核酸和基准核酸获得的Ct值来确定靶分子的绝对或相对拷贝数(Gibson等人；Genome Research 6：995～1001；Bieche等人，Cancer Research 59：2759～2765，1999；WO 97/46707；WO 97/46712；WO97/46714)。在图1中的基线区域15的末端处的区域20中的肘值将在循环数36左右。