[发明专利]同型二聚体形式的PLGF-1

权利要求书

1.一种分离的胎盘生长因子(PlGF)同型二聚体，其特征在于形成所述同型二聚体的两个单体蛋白质的C-端半胱氨酸残基参与单体间二硫键。

2.根据权利要求1所述的PlGF同型二聚体，其特征在于所述同型二聚体含有两个或三个单体间二硫桥。

3.根据权利要求1或2所述的PlGF同型二聚体，其特征在于所述C-端二硫桥在各单体中选自如下位置的两个Cys-残基之间：重组PLGF-1的位点125、wtPLGF₁₃₁的位点124、重组PLGF-2的位点146、wtPLGF₁₅₂的位点145、重组PLGF-3的位点197、wtPLGF₂₀₃的位点196、重组PLGF-4的位点218、wtPlGF₂₂₄的位点217。

4.根据权利要求1或3所述的PlGF同型二聚体，其特征在于PLGF是重组PLGF-1以及所述二硫桥在Cys⁶⁰-Cys⁶⁹、Cys⁶⁹-Cys⁶⁰和Cys¹²⁵-Cys¹²⁵之间。

5.一种用于制备根据权利要求1至4任一项所述PlGF同型二聚体的方法，包括如下步骤：

I.获得PlGF单体蛋白质；

II.通过将其孵育在具有从中性到碱性pH的缓冲液中和/或以不干扰氧化的程度去除任何还原剂，如果有的话，或者使还原剂失活来氧化所述单体，从而获得所述PLGF同型二聚体；以及任选地

III.纯化所述PLGF同型二聚体。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述步骤I包括在含有还原剂且具有从中性至碱性pH的缓冲液中孵育含有三个以内链间二硫桥的PlGF同型二聚体，从而获得PLGF单体蛋白质。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述步骤I包括在含有变性剂的缓冲液中孵育含有PLGF的细菌包涵体，并用还原剂还原如此获得的蛋白质溶液。

8.根据权利要求5至7任一项所述的方法，其中所述还原剂选自三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP*HCl)和二硫苏糖醇(DTT)或其混合物。

9.根据权利要求5至8任一项所述的方法，其中以5∶1-100∶1范围以内的还原剂/PLGF蛋白质摩尔比使用所述还原剂。

10.根据权利要求5至9任一项所述的方法，其中使用所述还原剂进行范围从10至30小时时间的孵育。

11.根据权利要求50至10任一项所述的方法，还包括纯化所述PLGF单体蛋白质。

12.根据权利要求5所述的方法，其中通过在包括15°至30℃度之间的温度下在缓冲液中孵育来进行步骤II中的氧化。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述氧化进行包括12至48小时之间的时间。

14.根据权利要求5至13任一项所述的方法，其中通过稀释、透析或用不含任何还原剂的缓冲液置换所述缓冲液进行步骤II中去除还原剂或使还原剂失活。

15.根据权利要求5至13任一项所述的方法，其中通过纯化单体进行还原剂的去除。

16.根据权利要求5所述的方法，其中通过色谱纯化进行步骤III中所述纯化。

17.根据权利要求1至4任一项所述的分离的PlGF同型二聚体，用于医学治疗。

18.根据权利要求17所述的PlGF同型二聚体，用于在有此需求的受试者中促进血液干细胞的动员。

19.根据权利要求18所述的PlGF同型二聚体，其中所述受试者是经受化疗的患者。

20.根据权利要求17所述的PlGF同型二聚体，其中所述医学治疗是缺血性疾病的治疗。

21.根据权利要求20所述的PLGF同型二聚体，其中所述缺血性疾病是心肌组织缺血、心肌梗塞、缺血性发作和慢性缺血性心肌疾病脑缺血和缺血性发作、肠缺血、四肢外周缺血。