[发明专利]用于通过在转化过程中诱导BBM提供可育植物的方法

说明书

本发明涉及一种用于提供成熟的转基因植物的方法，其中所述植物是顽拗植物（recalcitrant plant）。本发明还涉及可通过本发明方法获得的成熟的转基因植物、其植物材料、其后代、其植物部分、其种子或其克隆。本发明还涉及通过本发明方法获得的成熟转基因植物或其植物部分作为共转化系统的用途。

转基因是生命科学领域中使用的并且本身可用在多种生物体中以实现多种目的的方法。此技术已经并且正在大量在生命科学研究的许多领域中应用。此技术的一个方面是其可用于鉴别单个核苷酸分子（例如遗传元件和/或基因）或由这类核苷酸分子编码的蛋白的功能。所得到的转基因生物可用于基础或应用研究或者用于工业应用。

转基因在是植物科学领域中一种强有力的技术，因为它使得可将目的核苷酸分子转移到受体植物物种中。这种核苷酸分子可包含蛋白质功能基因的启动子、基因、终止子、抑制子或增强子等。

例如，转基因可用于研究将目的蛋白加至受体植物中的效应。在这样的情况下，将编码目的蛋白的基因——其通常是较大核苷酸分子的一部分——引入所述受体植物。

为了获得转基因植物，可应用这样的方法，即所述方法包括转化，然后再生，之后使转化的、再生的植物材料发育成为成熟的转基因植物。这种方法只可以成功地适用于特定的植物物种，所述植物物种易于进行所述转化和再生阶段以及随后成为成熟转基因植物的进一步发育。这种植物物种包括例如拟南芥（Ariabidopsis thaliana）或油菜（Brassica napus）。

在转化过程中，目的核苷酸分子被引入植物细胞。在再生过程中，使转化的植物材料从一定程度上未定型的结构（例如愈伤组织）发育为植物器官（例如叶状结构（leaf like-structure）、芽状结构（shoot-like structure）或体细胞胚（somatic embryo）），从而使得可由其得到成熟的转基因植物。

所述转化阶段可包括使植物细胞或植物材料与包含Ti（肿瘤诱导）质粒的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefciens）接触，所述质粒含有目的核苷酸分子。所述Ti质粒至少包含由根癌农杆菌转移到宿主植物中的DNA区段，即T-DNA元件。所述T-DNA元件的侧翼是DNA重复序列，即所谓的左边界和右边界。基因工程允许将目的核苷酸分子置于Ti质粒的左右T-DNA边界之间。在所述植物细胞或植物材料与所述根癌农杆菌的接触过程中，至少所述Ti质粒的T-DNA元件——包括目的核苷酸分子——被从根癌农杆菌转移到所述植物细胞中，在这里所述元件被稳定整合到核基因组或细胞器基因组（例如线粒体或叶绿体的基因组）中。其他转化方法也可应用于植物材料。

当从宏观角度考虑合适的再生时，再生中的植物细胞或组织可发育成无定形细胞团块（即愈伤组织），从所述愈伤组织可形成芽状结构或叶状结构。通常，如果需要，在合适的植物激素的影响下，从这样的结构可形成伸长的茎。随后，如果需要，在一种或多种合适的根诱导剂的影响下，这类结构会开始形成根系统以发育成适于支持进一步发育的高级根系统。随后，可将处于合适的高级发育阶段的植物材料从试管内（in-vitro）环境移植到试管外（ex-vitro）环境。随后将所述植物在允许获得成熟转基因植物的合适条件下进行试管外培养，例如在土壤、蛭石、岩棉等中培养。所述再生过程可包括此一般概念的附加或替代步骤。或者，再生可通过形成体细胞胚来进行，所述体细胞胚可长成成熟的植物。

这种转化和再生的方法优选地适用于幼小的植物体细胞组织，所培养的细胞（例如原生质体或器官）作为起始材料。这些组织（例如幼小植物组织的外植体或来自幼苗的植物材料块）包含具有不同分化程度或决定程度的细胞。可能是由于在这些组织中存在具有不同分化水平或程度的异源细胞群，因此这些组织对再生处理的初始阶段特别敏感。

仅有一些植物或植物物种被证明对转化和再生方法反应良好。已经可以以较简单的方式应用已知方法来转化和再生这些植物。相反，已证明其他植物或植物物种对这些转化和再生方法无反应。这些植物不以合适的方式再生并且/或者根本不能再生为成熟植物。这些植物、植物变种（variety）或植物栽培种被称为“顽拗”或“再生无能(regeneration incompetent)”。

哪些内在的分子或生理因子起作用或决定植物是否顽拗在很大程度上是未知的。这表明目前需要开发可适用于多种植物物种的可靠的植物特异性转化和再生方法。事实上，仅针对少数物种或物种的栽培种开发出了用于有效提供成熟转基因植物的合适转化和再生方法。