[发明专利]新荧光染料及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及荧光染料，更具体地说，涉及紫外线可激发的荧光染料组合物、化合物和共轭物，以及它们的使用和制造方法。

背景技术

荧光染料被广泛用于标记、检测、和/或定量样品中的组分。用于这样的检测和/或定量的多种方法包括荧光显微术、荧光免疫测定、细胞的流式细胞计数分析、以及多种其他应用。一般来讲，对于利用荧光染料作为检测工具的许多应用，有必要将荧光染料共轭于配体比如蛋白质、抗体、酶、核苷酸、核酸、以及其他生物学和非生物学分子来制备被染料标记的配体。被染料标记的配体是重要的可赋予特异性用于随后的生物化学反应的试剂，在所述生物化学反应中，荧光染料可提供一种用于检测和/或定量该反应的方法。

荧光染料的选择在采用多重、多色分析的应用、以及多种其他应用中特别重要，比如该分析是荧光显微术、荧光免疫测定、流式细胞术。显著地，某些检测应用需要紫外线可激发的具有特定激发范围的荧光团。

具体地说，需要这样一种荧光染料：其在多色流式细胞仪中能够被405nm紫色激光有效地激发。用于这些应用的标靶染料实质上应该具有下述特征：1)在405nm附近其激发光谱有最大值，2)有强的可光谱分辨的发射最大值，3)有大的斯托克斯频移(Stokes’shift)，优选至少50nm，以及4)荧光染料有通过反应基团偶联于生物分子的能力。迄今为止，一直缺乏一种紫外线可激发的荧光团，其能够被共轭于不同的配体从而提供被染料标记的试剂，所述试剂具有可光学和电子学分离的荧光光谱特性。

本发明的荧光染料在结构上类似于萤火虫荧光素化合物。这些化合物此前已经用作化学发光试剂，借由该试剂通过荧光素的氧化催化而产生光。荧光素是荧光素酶这种酶的底物，其在荧光素酶存在的条件下被氧化从而产生氧化荧光素和能量，该能量以光的形式被释放。对于这些类型的测定，荧光素酶-荧光素反应为用于众多物质的简单、快速、敏感的测定法提供了基础(Karicka，LJ.，Analytical Biochemistry，175，14-21(1988))。

虽然这些以萤火虫荧光素的结构为基础的化学发光染料已经获得广泛应用，但这样的使用并不能证明具有类似于萤火虫荧光素结构的化合物有如下能力：具有在特定部分的紫外光谱内可激发的荧光染料的功能。这样的紫外线可激发的荧光染料特别有利于大范围的应用，这些应用包括，但不限于，利用多重、多色荧光分析的那些应用。

发明内容

本发明涉及新颖的紫外线可激发的大体以萤火虫荧光素结构为基础的荧光染料、包含该荧光染料的组合物、该荧光染料的中间体、和它们的使用方法。

在一个方面，提供具有下述通式(I)的荧光染料的组合物：

其中，

X₁和X₂独立地是S或者O；

Y₁和Y₂独立地是卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、或烯基，或者Y₁或Y₂中的一个是H、而另一个是卤代烷基；

其中每个W独立地是H或烷基；

Z₁是H或烷基；

其中Z₁和一个W基团可以缺失，并且如果缺失，它们就被环C中的C₄和C₅之间的附加键所替代，该附加键被标示为虚线；

Z₂包含化学式为-L-RG的标记性取代基，其中L是键或连接基团；并且

RG是能够使荧光染料结合于另一个分子上的反应基团。

在另一个方面，提供了用于合成本发明荧光染料的合成中间体。在一种实施方式中，合成中间体由如下通式表示。

其中，

Y₁和Y₂独立地是卤素、烷基、卤代烷基、烷氧基、或烯基，

或者Y₁或Y₂中的一个是H、而另一个是卤代烷基。

在另一个方面，提供了包含共轭于生物分子的荧光染料的染料-共轭物。

在另一个方面，提供了使用荧光染料和染料-共轭物的方法，用来定位或者检测样品中的分析物或者配体的存在或相互作用。在特定的实施方式中，提供了使用染料-共轭物的方法，用于检测结合于染料-共轭物的互补生物分子的存在。