[发明专利]核酸扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸扩增方法，特别是使用经化学修饰的引物和环状单链DNA的组合的核酸扩增方法、利用上述方法检测是否存在目标基因的方法以及在上述方法中使用的检测用试剂盒。

背景技术

现在，在研究机构、医疗机构、检查机构及其它各种现场，基于目标基因的特异性碱基序列的分析方法和检测方法被广泛使用。例如，在分析和检测人和动物等生物体来源的试样(体液或细胞片)或来源于环境的试样中所含的病原菌、霉菌、螨等过敏原等病原性的微生物和微小动物、病毒和花粉等的存在时，也采用了检测这些检测对象所具有的目标基因的特异性碱基序列的方法。检测这些核酸(DNA、RNA)的方法与检测蛋白质的方法相比，能够在短时间内以高灵敏度进行。而且，即使试样中原本所含的核酸量在检出限(detection limit)以下，也可以使用无细胞系较为简单且特异性地扩增。由于这些优点，利用扩增核酸的方法或与扩增核酸的方法组合来检测目标基因中的特异性碱基序列的方法被广泛开发。

目前，作为最常用的核酸扩增方法，可以列举利用温度循环进行数十次的模板的变性、引物与模板的退火、DNA聚合酶延伸反应的循环，从而扩增夹在引物对之间区域的核酸的PCR法。但是，在利用温度循环扩增核酸的方法中，存在用于控制温度循环的机器(热循环仪等)价格高、需要对核酸扩增的最佳温度循环进行研究和设定等问题，因此近年来开始考虑不利用温度循环而在一定温度条件下进行DNA聚合酶延伸反应的核酸扩增方法。其代表性的方法可列举LAMP(环介导等温扩增，Loop-Mediated Isothermal Amplification)法(专利文献1)，除此之外，为了克服成本、检测方法的设计和操作、检测灵敏度等问题，还正在开发利用与环状单链DNA的组合的核酸扩增方法(专利文献2)。

但是，即使利用上述方法，在试样中所含有的检测对象核酸为微量的情况下，也存在检测灵敏度未必充分的情况。因此，需要扩增效率和检测灵敏度进一步提高的新的核酸扩增方法和检测方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2000/28082号小册子

专利文献2：国际公开第2008/026719号小册子

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种基于新原理的核酸扩增方法，该方法能够简便地且在短时间内高效扩增具有特定碱基序列的核酸；另外提供利用了该方法的核酸检测方法。

用于解决问题的方案

本发明人发现，对具有特异性碱基序列的模板核酸分子，通过使用具有与上述碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物以及含有上述特异性碱基序列的环状单链DNA的组合，连锁地进行DNA聚合酶延伸反应，能够解决上述课题，由此完成了本申请发明。

即，本发明提供一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：

(a)使用含有扩增对象碱基序列的模板DNA、和包含具有与上述碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对来进行DNA聚合酶延伸反应，得到直链状DNA片段；和

(b)以含有扩增对象碱基序列的环状单链DNA作为模板，以由(a)得到的直链状DNA片段的3’端作为复制起点，进行链取代型DNA聚合酶延伸反应。

另外，本发明提供一种核酸扩增用试剂盒，其含有：

(i)包含具有与扩增对象碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对；

(ii)含有扩增对象碱基序列的环状单链DNA；

(iii)链取代型DNA聚合酶；

(iv)dNTP。

另外，本发明提供一种检测双链的目标核酸分子的方法，其包括：

(a)在检测对象试样中添加包含具有与目标核酸分子的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对、含有目标碱基序列的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；

(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；和

(c)在核酸被扩增时，确定检测对象试样中存在双链的目标核酸分子。

另外，本发明提供一种检测单链的目标核酸分子的方法，其包括：