[发明专利]胶原新表位抗体

说明书

技术领域

本发明涉及可以识别胶原新表位的单克隆抗体，基于所述抗体的免疫测定、基于所述抗体的测定方法、基于所述抗体的筛选方法、基于所述抗体的患者鉴别方法和基于所述抗体的试剂盒。

背景技术

软骨降解是骨关节炎（OA）和慢性类风湿性关节炎（RA）等关节疾病的主要特征。监控此类疾病中软骨丢失的进展情况为管理疾病（包括预后、诊断和处置）提供有效的信息。目前，通过X射线检测关节腔变小来监控软骨丢失。但是，X射线诊断不能同时满足检测的灵敏度和准确度。而且，X射线只显示过去发生过软骨丢失，而不显示现在的软骨降解情况。因此，监控各种关节疾病中的软骨破坏的进展情况的替代方法是非常有价值的。

目前已知软骨中的胶原分解是通过被称为基质金属蛋白酶（MMP）的一组酶进行的。特别地，鉴于只有胶原酶（MMP-1、MMP-8和MMP-13）负责切断未变性的II型胶原的3重螺旋，认为胶原酶在975-976位的氨基酸残基之间的切断是之后由明胶酶等多种蛋白酶造成II型胶原从软骨基质脱离的关键事件。此外，此处的氨基酸残基参照GenBank数据库：COL2A1（登录号：NP001835）的全长序列。

降解后的胞外基质蛋白的片段从软骨释放到滑液中（SF），之后通过血液在全身循环。因而，虽然血清或尿中的软骨基质蛋白质片段的水平通常低于SF中的水平，但如果可以对其检测，则能够更简便地评估OA和RA中的软骨降解。

关于测定全身II型胶原片段存在2个主要问题。第一，关节软骨中的II型胶原的周转（turnover）通常非常低，因而血清或尿中的II型胶原片段的水平也非常低。即使OA软骨中II型胶原的转换增加，所述增加也不是明显容易检测的非常大的变化。因而需要灵敏度非常高的测定。

第二个问题是构成胶原的大部分脯氨酸和赖氨酸残基被羟基化修饰。特别地，由于脯氨酸是占胶原蛋白约3成的主要组成成分，在胶原酶切割位点附近也存在羟化脯氨酸，已知该羟化对结合亲和力具有很大影响。

包含在胶原中的脯氨酸的羟基化是由脯氨酰4-羟化酶以依赖于铁离子和维生素C的方式催化的，因此，羟基化程度易受胶原合成时的营养状态等的影响，不是恒定的。因而，期望的是用于测定II型胶原片段的抗体的结合亲和力不受脯氨酸有无羟基化的影响。

迄今为止，已经发明了若干测定由胶原酶产生的II型胶原片段的系统，但无一具有足够的灵敏度、准确度。例如在Robin Poole等人的应用单克隆抗体COL2-3/4C long（专利文献1）的竞争性ELISA方法中，对于胶原酶切割端结构的特异性低，且对于切割位点上游第5位（从N末端起第971位）的脯氨酸的非羟基化形式几乎没有反应性（非专利文献1）。此外，对于使用Otterness等人的单克隆抗体9A4（专利文献2）的夹心ELISA方法，对于胶原酶切割端结构的特异性高，但由于从切割端起上游第5个残基（从N末端起第971位）的脯氨酸的羟基化，结合亲和力降低至约1/90（非专利文献2）。因此，对于大部分为羟基化形式的II型胶原片段的检测灵敏度低。

由此可见，目前为止的任一种抗体都易于受胶原酶切割位点紧邻的脯氨酸羟基化修饰的影响，不能正确地测定羟基化形式和非羟基化形式混合存在的生物样品中的胶原片段的量。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特许第2999416号

专利文献2：特许第3258630号。

非专利文献

非专利文献1：J Immunol Methods 294 (2004) 第145-153页

非专利文献2：J Immunol Methods 247（2001）第25-34页。

发明内容

发明要解决的课题

本发明要解决的课题是正确地测定生物样品中由胶原酶消化产生的胶原片段（胶原新表位）的量。

用于解决课题的手段

本发明人深入研究了针对胶原新表位的单克隆抗体的制备，结果制备出新的单克隆抗体，即使新表位的脯氨酸变为羟基化形式，所述抗体的结合能力也不变化，从而完成了本发明。

换言之，本发明涉及：