[发明专利]用于实施测定法的方法和装置

说明书

技术领域

本发明涉及用于实施测定法的方法和装置尤其，本发明涉及可以用于实施测定法、尤其多步骤测定法的可转动平台。尽管已经主要开发本发明用于通过焦磷酸测序法对核酸测序，并且下文将参考这种应用描述本发明，然而将理解，本发明不限于这种具体使用领域。

背景技术

提供以下的现有技术讨论以将本发明置于适宜的技术背景下并且能使本发明的优点更充分地理解。然而，应当理解在本说明书通篇范围内对现有技术的任何讨论不应当视为表示或暗示承认这种现有技术是广泛已知的或形成本领域公知常识的部分。

测定DNA核苷酸序列的能力在最近时间变得日益重要。以往，两种最常使用的DNA测序方法是酶促链终止方法和化学切割技术，二者均依赖于凝胶电泳以根据大小解析从更大DNA区段产生的DNA片段。电泳步骤和检测分离的DNA片段是繁琐的过程。然而，尽管自动化电泳装置是市售的，电泳法不充分适合大规模基因组计划或临床测序，在这些情况下需要在高通量情况下相对有成本效益的装置。因而，对非电泳测序方法的需求是明显的。

能够快速检测单一DNA碱基变化的技术也是遗传分析的重要工具。先前描述了基于固相原理的最小测序方案，其中测量放射标记的核苷酸的掺入并且将其用于分析人载脂蛋白E基因的三种等位多态性。然而，放射性方法不充分适合例行临床应用，并且因而，开发用于快速DNA序列分析的简单、非放射性方法还具有意义。

先前已经描述了基于检测聚合酶反应期间释放的无机焦磷酸盐(PPi)的构思的测序方法(见国际PCT公开号WO93/23564和WO89/09283)并且所述方法通常称作焦磷酸测序法。随着聚合酶反应期间每个核苷酸添加至正在生长的核酸链时，释放焦磷酸分子。已经发现可以例如通过萤光素酶-萤光素反应中光的产生酶促地检测在这些条件下释放的焦磷酸。此类方法能够鉴定靶位置内的碱基并且能够对DNA简单和快速地测序，同时不需要电泳和使用有害的放射标记物。

用于实施焦磷酸测序法的早期现有技术方法使用0.2mL微量离心管(或相似物)同时依次添加试剂至该管以检测该管中存在的DNA的序列。尽管这种方法是相对简单的，但是该方法遭遇以下缺点：读出长度短，原因是该反应因每次添加核苷酸试剂而稀释和/或反应副产物积累并且反应条件达到该反应不再继续进行的程度。例如，通常仅可以用这种方法可靠地测得约80个碱基。

也已经开发了利用焦磷酸测序法的商业设备。这些系统使用流动小室来进行靶DNA/RNA分子的杂交。旨在解释，通常通过固定双链DNA并且使互补链变性，将单链DNA固定在位于流动小室中的静止珠上。使包含核苷酸(A、G、C或T)的试剂流经该珠，并且如果掺入核苷酸，则检测到光。光的信号强度与单个反应中掺入的核苷酸的数目成正比。在该珠暴露于不同核苷酸之间，还进行洗涤步骤，并且重复该过程以检测下一个核苷酸的掺入。

还已知借助合成的其他测序方法，例如通过使用荧光标记的核苷酸。在这种方法中，首先将DNA样品片段化并且将DNA双螺旋解链成单链。在流动小室内部的表面上捕获单链DNA分子并且所述单链DNA分子充当合成测序方法的模板。将荧光标记的核苷酸一次添加一种并且由DNA聚合酶掺入正在生长的互补链中。洗去未使用的核苷酸。一旦用激光照亮，则掺入的核苷酸发射可检测到的光。在添加下一个核苷酸以继续该循环之前，除去荧光标记物。对核苷酸掺入的追踪确定每个单独DNA分子的精确顺序。

借助连接的测序法也是已知的。这种DNA测序方法使用DNA连接酶来鉴定DNA序列中给定位置处存在的核苷酸。DNA连接酶的错配敏感性用来确定靶DNA分子的潜藏序列。例如见美国专利号5,750,341和US4,883,750。

需要用于实施测定法和分析的装置，所述装置可以随多种化学和检测方法一起使用，和尤其用于实施包括多重反应和洗涤步骤(如核酸测序中所用的多重反应和洗涤步骤)的测定法的装置。另外，需要这样的装置，所述装置可以用作要求流通环境的测定法的便利替代物或用来替换其中在核酸测序情况下稀释效应限制最大测序读出长度的固定反应容器测定法。

本发明的目的是克服或改进上述现有技术的缺点中至少一者或是提供有用的替代物。

发明内容

根据第一方面，本发明提供一种用于实施测定法的可转动平台，所述平台适应于在所述平台的表面上的一个或多个分立区域内固定第一结合配偶体。

根据第二方面，本发明提供一种用于实施测定法的可转动平台，所述平台适应于在所述平台的表面上的一个或多个分立区域内选择性固定第二结合配偶体。