[发明专利]具有经修饰的前原区域的蛋白酶

说明书

技术领域

本发明涉及编码经修饰的蛋白酶的经修饰的多核苷酸，本发明还涉及用于改变蛋白酶在微生物中的生产的方法。特别地，经修饰的多核苷酸包含一个或多个突变，编码具有改变的前原(pre-pro)区域的经修饰的蛋白酶，所述修饰的前原区域增强该活性酶的生产。本发明还涉及用于改变蛋白酶在微生物(例如芽孢杆菌属(Bacillus)物种)中的生产的方法。

背景技术

细菌来源的蛋白酶是重要的工业酶，其占所有酶销售量的大多数，在多种工业(包括洗涤剂、肉嫩化、干酪制造、脱毛、烘焙、酿造、助消化剂的生产、以及从摄影胶片回收银)中被广泛应用。这些酶作为洗涤剂添加剂的应用促进了它们的商业发展，并导致对这些酶的基础研究的大幅扩增(Germano等，Enzyme Microb.Technol.32：246-251[2003])。除了作为洗涤剂和食品添加剂，蛋白酶(例如，碱性蛋白酶)在其它工业领域(例如皮革、纺织、有机合成、以及废水处理)中也具有广泛的应用((Kalisz，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，36：1-65[1988])和(Kumar和Takagi，Biotechnol.Adv.，17：561-594[1999]))。

随着对这些工业酶的高要求，具有新颖特性的碱性蛋白酶持续成为研究兴趣的重点，从而导致了具有改良的催化效率和对温度、氧化剂及变化的使用条件具有更佳稳定性的新蛋白酶制剂。然而，酶生产和下游加工的总成本仍然是酶工业中任何技术成功应用所面临的主要障碍。为了解决这个问题，研究人员和工艺工程师采用了几种方法，相对于碱性蛋白酶的工业需求，增加碱性蛋白酶的产量。

尽管采用了多种方法(包括筛选高产菌种、克隆和过表达蛋白酶、改进补料分批发酵和恒化器发酵、以及优化发酵技术)来增加蛋白酶的产量，但仍然需要额外的手段来提高蛋白酶的生产。

发明概述

本发明提供经修饰的多核苷酸，其编码经修饰的蛋白酶；本发明还提供用于改变蛋白酶在微生物中的生产的方法。特别地，经修饰的多核苷酸包含一个或多个突变，编码前原(pre-pro)区域具有修饰的经修饰的蛋白酶，所述前原区域的修饰增强该活性酶的生产。本发明还涉及用于改变蛋白酶在微生物(例如芽孢杆菌属物种)中的生产的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了编码经修饰的全长蛋白酶的分离的修饰多核苷酸，其中该分离的经修饰的多核苷酸包含编码该全长蛋白酶的前原区域的第一多核苷酸，该第一多核苷酸有效地连接到编码该全长蛋白酶的成熟区域的第二多核苷酸上，其中第一多核苷酸编码SEQ ID NO：7的前原区域，并进一步被突变而包含至少一个增强该蛋白酶在宿主细胞中的生产的突变。优选地，宿主细胞为芽孢杆菌属物种宿主细胞，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主细胞。在一些实施方案中，经修饰的全长蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，其源自野生型的或变体的亲本丝氨酸蛋白酶，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的丝氨酸蛋白酶。

在另一个实施方案中，本发明提供了分离的、经修饰的多核苷酸，所述多核苷酸编码经修饰的全长蛋白酶，其中该分离的、经修饰的多核苷酸包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸编码该全长蛋白酶的前原区域，并有效地连接到第二多核苷酸，所述第二多核苷酸编码全长蛋白酶的成熟区域，其中第一多核苷酸编码SEQ ID NO：7的前原区域，并进一步被突变以包含至少一个增强宿主细胞的蛋白酶生产的突变，第二多核苷酸编码与SEQ ID NO：9的成熟蛋白酶至少约65％相同的蛋白酶。优选地，第二多核苷酸编码SEQ ID NO：9的成熟蛋白酶。在一些实施方案中，经修饰的全长蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，其源自野生型的或变体的亲本丝氨酸蛋白酶，例如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶。优选地，宿主细胞为芽孢杆菌属物种宿主细胞，例如枯草芽孢杆菌宿主细胞。