[发明专利]5.9kDa肽的免疫学测定方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及用于从待测样品检测通过蛋白质组解析发现可作为肝脏疾病用肽标记物利用的，人纤维蛋白原α-E链、或者，是人纤维蛋白原α链的分解产物，有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的分子量5，900的肽(以下，称之为5.9kDa肽)、或者，定量待测样品中的5.9kDa肽浓度的免疫学测定方法、及，免疫学测定用试剂盒。另外，本发明涉及5.9kDa肽的免疫学测定方法中使用的，识别5.9kDa肽的N末端区域的抗体及识别C末端区域的抗体。

【背景技术】

近年，在世界规模进行一并的蛋白质组解析，也广泛进行使用蛋白质组解析的疾病标记物的探索(专利文献1～2、非专利文献1～3)。在蛋白质组解析中，一般而言，各自分离作为活体来源样品中包含的蛋白质或其分解产物的肽，用质谱分析装置解析分离的蛋白质或肽的氨基酸序列，核对得到的氨基酸序列和数据库中的氨基酸序列，由此鉴定样品中包含的蛋白质或肽。由于根据疾病的有无而在活体内表达的蛋白质不同，通过蛋白质组解析而有可将发现疾病特异性地表达量增减的蛋白质或肽作为其疾病标记物利用的可能性。

通过蛋白质组解析，本发明人从在以戒酒目的住院的酒精依赖症患者中经时采集的血清待测样品，作为伴随习惯饮酒而增减的新颖的血清肽之一鉴定了5.9kDa肽，发现可将这作为肝脏疾病诊断标记物利用(专利文献1、非专利文献1-2)。

另外，本发明人发现，使用由54个残基组成的5.9kDa肽的全长肽作为抗原而得到的两种类的单克隆抗体，使单离的5.9kDa肽的免疫学测定成为可能(专利文献1)。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：国际公开第2004/058966号

专利文献2：国际公开第2004/090550号

【非专利文献】

非专利文献1：Nomura，F.et al.，Proteomics，4，1187-1194，2004

非专利文献2：Nomura，F.et al.，J.Chromatogr.B.，855，35-41，2007

非专利文献3：Hanash，S.M.et al.，Nature，452，571-579，2008

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

至今，使用蛋白质组解析报告了几种临床上有用的肽。但是，在本发明人所知的范围内几乎未见到使用在临床诊断的领域广泛一般地使用的免疫学的检测方法而定量测定这些的疾病标记物候选肽的报告。此免疫学测定方法的确立困难的点妨碍通过蛋白质组解析发现的肽标记物的普及。

作为免疫学测定方法的确立困难的原因，第一，可举出对肽的特异性抗体的制备困难。第二，可举出通过蛋白质组解析发现的肽也多为活体来源样品中存在的成熟的蛋白质的分解产物，包含作为目的的肽的序列的目的肽以外的多种分解产物混在于样品中。这时，即便将作为目的的肽作为免疫原制出抗体，也发生与混在的分解产物的非特异性的反应，无法正确地定量分析目的肽。

特别是，通过分解作为本发明的测定对象的5.9kDa肽而产生的人纤维蛋白原是与凝固-纤溶系统无关的蛋白质，活体内大量存在其分解物。具体而言，纤维蛋白原在凝固系统中被凝血酶分解而产生纤维蛋白单体。在纤溶系统中，由于由纤维蛋白单体构成的纤维蛋白聚合物由纤溶酶在多个部位被分解，必然产生多个纤维蛋白原分解产物。

例如，根据数据库PeptideAtlas(http://www.peptideatlas.org/)中的build Human Plasma PeptideAtlas 2009-05，作为人纤维蛋白原α-E链(数据库内蛋白质名：ENSP00000306361)的分解产物观测到239种的肽。

如前所述，本发明人成功进行了，对将由54个残基组成的5.9kDa肽的全长肽作为抗原的5.9kDa肽的两种类的单克隆抗体的制成、及，单离的5.9kDa肽的免疫学测定(专利文献1)。但是，即便使用这些单克隆抗体，在充分地正确地测定有包含多个人纤维蛋白原分解产物的可能性的待测样品中的5.9kDa肽的定量中也有再改良的余地。

鉴于此实状，本发明的课题在于提供从有包含多个人纤维蛋白原α-E链/α链分解产物的可能性的待测样品特异性地检测5.9kDa肽而定量的免疫学测定方法。而且，本发明的课题旨在提供用于在该免疫学测定方法中使用的试剂盒以及该免疫学测定方法及该试剂盒中使用的识别5.9kDa肽的N末端区域的抗体及识别C末端区域的抗体。

【解决课题的技术方案】