[发明专利]核酸探针以及检测疟原虫寄生虫的方法

说明书

发明的背景技术

疟原虫是一种寄生性原生动物属。已知被这种属感染会形成疟疾。在寄生虫的生命周期中始终存在着两个宿主：蚊子带菌者以及脊椎动物宿主。至少有十个种类会感染人类，其包括恶性疟原虫(P.falciparum)，间日疟原虫(P.vivax)，三日疟原虫(P.malariae)，以及卵形疟原虫(P.ovale)。疟疾是一种传染性疾病，其普遍存在于热带地区以及亚热带地区。疟疾对于男人、女人以及儿童的生存而言象征着一种威胁。它每年感染300百万至500百万人，并且每年导致1百万至3百万人的死亡，这些大部分都发生在撒哈拉以南的非洲地区的儿童中。

疟疾是最常见的传染性疾病中的一种，并且是一种极大的公共卫生问题。上述疾病是由疟原虫属的原生动物寄生虫引发的。上述疾病中最严重的类型是由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)以及间日疟原虫(Plasmodium vivax)所引发的，但是其他相关的种类(卵形疟原虫(Plasmodium ovale)以及三日疟原虫(Plasmodium malariae))同样能够感染人类。确定上述的感染性种类能够帮助确定所述患者的治疗方案。

疟疾的优选并且最可靠的诊断方法是对血膜进行显微镜检验，因为上述四种主要的寄生虫种类中的每一种都具有不同的特性。传统使用到的是两类血膜。薄膜类似于常规的血膜，并且能够进行种类的识别，因为在这种方法中所述寄生虫的外观能得以最好的保存。厚膜使得显微镜操作人员能够筛选出更大量的血液，并且其敏感性比上述薄膜的敏感性高出大约十一倍，因此在所述厚膜上识别低水平的感染比在薄膜上识别更加容易，但是所述寄生虫的外观则被扭曲的多，并且因此在区别不同的种类上存在更大的困难。

从上述厚膜中，有经验的显微镜操作人员能够检测到的寄生虫的水平(或者寄生虫血症)下降到低至红血球的0.0000001％。然而，显微镜诊断可能存在困难，因为所有四个种类的早期营养体(“环形体”)看起来是相同的并且根本不可能基于单个的环形体来诊断其种类；种类的识别始终要以几种营养体为基础来进行的。

在无法利用显微镜方法的情况下，利用抗原检测试验，该方法仅需要一滴血液。OptiMAL-IT(TCS Bio Sciences，白金汉郡，英格兰)将可靠的检测到下至0.01％寄生虫血症水平的恶性疟原虫(falciparum)以及下至0.1％水平的非恶性疟原虫。Paracheck-Pf(Orchard Biomedical Systems，印度)将检测到下降至0.002％水平的寄生虫血症，但其不能够区分恶性疟原虫疟疾以及非恶性疟原虫疟疾。也可以利用聚合酶链式反应对寄生虫的核酸进行检测。这项技术比显微镜方法更加准确。然而，这项技术昂贵并且需要专门的实验室。并且，寄生虫血症的水平并不必然与所述疾病的程度相互关联，特别是在当所述寄生虫能够粘附于血管壁的情况时。在一些临床实验室以及快速实时检测中可以利用的分子方法是有限的，例如，QT-NASBA(基于聚合酶链式反应的实时定量核酸序列依赖性扩增)，但其目前需要进行改进。因此，为了在上述领域检测低水平的寄生虫血症，需要研制敏感的、低科技的诊断工具。

我们所需要的是能够快速并且准确的检测到并辨别出引起疟疾的各种疟原虫种类的试剂以及方法。

发明内容

本发明涉及能够在例如杂交检测中检测到并且辨别出不同种类的疟原虫寄生虫的核酸探针。因此，在第一个方面，本发明的特征在于用作探针的核酸片段，用于在杂交检测中检测疟原虫。本发明还包括能够辨别出恶性疟原虫(P.falciparum)，间日疟原虫(P.vivax)，三日疟原虫(P.malariae)以及卵形疟原虫(P.ovale)的探针(DNA，RNA以及PNA)。在本发明的内容中，所述术语“辨别”(或者类似的术语)指的是所述探针与来自于一个种类的核酸(例如，RNA，DNA，rRNA[核糖体RNA]或者rDNA[核糖体DNA])的结合比其他三个种类的结合更加顺利。

本发明的探针能够检测样品中特定种类的疟原虫同时不与其他种类的疟原虫发生任意显著程度的交叉反应。在这一点上，在检测不同的疟原虫种类时，本发明探针之间发生的交叉反应小于大约20％、小于大约15％、小于大约10％、小于大约5％或者小于大约2％。