[发明专利]电位敏感性荧光染料的荧光强度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过使用维生素E和/或胆固醇而使电位敏感性荧光染料的伴随电位或离子强度变化而产生的荧光敏化的方法或者使电位敏感性荧光染料的荧光强度增强的方法。本发明还涉及采用通过使用维生素E和/或胆固醇而得以敏化/增强的测定体系、对培养心肌细胞的活动电位进行测定的方法。本发明还涉及使用在基材的表面进行固相化的电位敏感性荧光染料、无论有无使用细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体均能对电位敏感性荧光染料的电位或离子强度变化进行测定的方法。本发明还涉及对使电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度依赖性荧光强度的变化率敏化的物质或者使荧光强度增强的物质进行选择的方法。

背景技术

心律不齐(arrhythmia)，不仅会大大降低患者的生活质量，有时还是威胁患者生命的疾病。此外，在应对各种疾病的药剂开发中，检测出对心肌细胞的电活动带来影响的副作用(例如，心律不齐)，回避该副作用是非常重要的。到目前为止，为了进行抗心律不齐药的开发以及对影响心肌的电活动的作用的检查，使用了动物及动物来源心肌细胞。但是，这些由于存在种差的问题，因此还不是足以用于人体的方法(非专利文献1：Biochem Biophys Res Commun.，Vol.385，p497-502，2009)。

最近，随着对人ES细胞、人iPS细胞的开发，表明人心肌细胞是通过这两种细胞分化而得到的。若有能够使用这两种细胞简便地取得人心肌细胞的活动电位的方法，则在药物开发活动中担负重要的作用。作为用来测定这样的人ES细胞、人iPS细胞细胞来源的心肌细胞的活动电位的方法，有设想使用电位敏感性荧光染料的方法的情况，但在使用了电位敏感性荧光染料的分析中，人ES细胞来源心肌细胞和人iPS细胞来源心肌细胞均由于对电位敏感性荧光染料的灵敏度不够而无法测定细胞的活动电位。

此外，一直使用的电位敏感性荧光染料只有在结合到细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体上的状态下才能测定电位。即，为了测定电位敏感性荧光染料的灵敏度，需要将水溶液中的电位敏感性荧光染料在细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体上进行固相化后对其进行实验，需要调制细胞或脂质双层膜脂质体等膜载体。该方式中，作为膜载体，需要调制脂质双层膜脂质体或需要使用细胞，因此，实验体系变得复杂，并且可能会导致各种人为构造(artifact)的介入。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Biochem Biophys Res Commun.，Vol.385，p497-502，2009

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于开发使电位敏感性荧光染料的依赖于电位或离子强度变化的荧光强度的移位敏化的方法、和/或使电位或离子强度依赖性的荧光强度增强的方法。本发明的目的还在于对迄今为止尚不能测定的来自ES细胞及iPS细胞的心肌细胞的活动电位变化进行测定。本发明的目的还在于能够在不使用细胞或脂质双层膜脂质体等物质(膜载体)的情况下简便地测定电位敏感性荧光染料的荧光强度、电位依赖性的荧光强度变化量。本发明的目的还在于使用该方法、开发用来对使电位敏感性荧光染料的荧光强度增强的物质进行筛选的方法。

用于解决问题的方案

本发明人等对各种物质进行筛选，发现：维生素E具有增强电位敏感性荧光染料的灵敏度的作用，而维生素E及胆固醇这两者均具有增强电位敏感性荧光染料的荧光强度的作用。而且，还明确了这两种物质能够组合，能够在通过维生素E增强电位敏感性荧光染料的灵敏度的同时通过胆固醇(或者胆固醇和维生素E的组合)增强电位敏感性荧光染料的绝对荧光强度。即，本申请发明的发明人等基于这些见解提供了一种对电位敏感性荧光染料的电位依赖性或离子强度变化依赖性的荧光强度变化进行测定的方法，其特征在于，对电位敏感性荧光染料添加电离性化合物而赋予电位或离子强度变化，再添加维生素E和/或胆固醇而使电位敏感性荧光染料的电位性或离子强度变化敏化。