[发明专利]MPL基因多态性检测用探针及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测MPL基因的多态性的探针及其用途。

背景技术

慢性骨髓增殖性疾病(MPD)是由造血干细胞的异常引起的克隆性疾病，为慢性骨髓性白血病(CML)、真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性骨髓纤维化(PMF)等的疾病的总称。已知一部分原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化症的患者体内，由于用于编码促血小板生成素受体的MPL(myeloproliferative leukemia)基因的突变，MPL蛋白质的第515位的色氨酸(W)被取代为亮氨酸(L)或赖氨酸(K)(非专利文献1)。已知取代为亮氨酸(L)的上述取代(W515L)，是由序列编号1中所示的MPL基因的碱基序列中的碱基序号11535的碱基鸟嘌呤(g)突变为胸腺嘧啶(t)而导致的，另外，取代为赖氨酸(K)的上述取代(W515K)是由于上述碱基序列中的碱基序号11534的碱基胸腺嘧啶(t)突变为腺嘌呤(a)以及碱基序号11535的碱基鸟嘌呤(g)突变为腺嘌呤(a)而导致的(非专利文献1)。因此，通过检测MPL基因中这些突变的有无，即通过检测多态性，例如，原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维症的诊断等就成为可能。

另一方面，作为检测基因的多态性的方法，报告了各种方法，例如，可举出PCR(Polymerase Chain Reaction)-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法等。

上述PCR-RFLP法中，针对试样的靶标DNA，利用PCR使检测目标的区域扩增，将该扩增物进行限制性内切酶处理，通过Southern杂交对由多态性导致的限制酶片段长的变化进行分型的方法。基因中存在目标突变时，限制性内切酶的识别位点会消失，因此可以检测切断的有无，即，通过限制酶片段长的变化，可以检测突变的有无。

然而，上述PCR-RFLP法，例如，在PCR之后，必须用各种限制性内切酶处理得到的扩增物并进行分析，费时费力。另外一旦从反应器取出扩增物就必须马上进行得到的扩增物的限制性内切酶处理。因此，有可能发生第1次的反应中得到的扩增物发生飞散，混入第2次的另外的反应。由于这种问题，多态性的检测难以自动化。

考虑到这样的问题，近年来，作为多态性的检测方法，Tm(Melting Temperature)分析备受关注。该方法如下：首先，使用与含有检测目标多态性的区域互补的探针，形成被检核酸和上述探针的杂交体(双链核酸)；然后，对得到的杂交体实施加热处理，通过吸光度等的信号的测定检测随着温度上升的上述杂交体向单链核酸的解离(熔解)；基于该检测结果来确定Tm值，由此判断多态性。上述杂交体中的两条单链核酸的互补性越高Tm值越高，互补性越低则Tm值越低。因此，检测对象位点的多态性为X或Y时，预先对于含有目标多态性(例如，Y)的核酸和与其100％互补的探针的杂交体求出Tm值(评价基准值)。接着，测定上述被检核酸和上述探针的Tm值(测定值)。然后，如果该测定值与上述评价基准值相同，则可以判断为上述被检核酸和上述探针为完全匹配，即，上述被检核酸的检测对象位点为目标多态性(Y)。另一方面，如果上述测定值比上述评价基准值低，可以判断为上述被检核酸和上述探针错配，即，上述被检核酸的检测对象位点为另一个多态性(X)。通过这样的方法，例如，仅仅对添加了上述探针的PCR反应液实施温度处理，进行信号测定，就可以进行多态性的检测。因此，检测装置的自动化成为可能。

然而，这样的利用Tm分析的检测方法，例如，必须通过Tm值对一个碱基的差异进行判断。因此，特别需要即使在野生型的多态性和突变型的多态性混合存在的情况下等，也能够正确地检测突变的有无。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Paradanani等著，Blood，2006年，Vol.108，No.10，p.3472-3476

发明内容

发明要解决的课题

因此，本发明的目的在于，提供一种能够简便且可靠性优良地对于MPL基因判别多态性的多态性检测用探针及其用途。

解决课题的方法

为了实现上述目的，本发明的多态性检测用探针是一种MPL基因的多态性检测探针，其特征在于，所述多态性检测探针为含有下述(P1)寡核苷酸的探针、含有(P1’)寡核苷酸的探针、含有(P2)寡核苷酸的探针和含有(P2’)寡核苷酸的探针中的至少一种。