[发明专利]多能干细胞

说明书

本专利申请要求于2009年10月29日提交的美国临时申请No.61/256,149的优先权，将该临时申请全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明提供了从成体细胞制备多能干细胞的方法。具体地讲，本发明提供了在不使用饲养细胞层或可增加逆转录病毒转染效率的试剂的情况下从体细胞制备多能干细胞的方法。

背景技术

用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞(例如胚胎干细胞或从成体细胞产生的多能干细胞)产生功能性β细胞。

从成体细胞产生的多能干细胞或“诱导型多能干细胞”或“IPS细胞”是通过诱导某些基因的“强制”表达而以人为方式来源于非多能细胞(例如成体体细胞)的多能干细胞类型。据信，诱导型多能干细胞与天然多能干细胞(如胚胎干细胞)在很多方面都相同，如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、有活力的嵌合体形成以及潜能和分化能力。

在一个例子中，Takahashi等人声称：“我们证明了通过在ES细胞培养条件下引入四个因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4，可从小鼠胚胎或成体成纤维细胞诱导多能干细胞”(Cell 126：663-676，2006)。

又如，Li等人声称：“我们揭示了基因重编程和化学条件相结合可产生和维持大鼠iPSC(riPSC)，从而产生畸胎瘤并且大大有助于产生嵌合体大鼠。采用相同的策略也足以产生非典型人iPSC(hiPSCs)，所述非典型人iPSC表现出与mESC类似的集落形态和自我更新要求/信号转导响应。”(Cell Stem Cell 4：16-19，2009)。

又如，Maherali等人声称：“四个转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4的异位表达足以将多能状态赋予成纤维细胞基因组，从而产生诱导型多能干(iPS)细胞。仍然未知的是，这四个因子诱导的细胞核重编程是否整体重置分化的细胞和多能细胞之间的表观遗传差异。在这里，我们使用新选择方法从成纤维细胞产生iPS细胞，以表征它们的表观遗传状态。雌性iPS细胞显示出体细胞沉默的X染色体的重新激活，并且在分化时经历了随机X失活。两个关键组蛋白修饰的全基因组分析表明iPS细胞与ES细胞高度类似。与这些观察相符的是，iPS细胞可产生有活力的高度嵌合体，并影响生殖细胞系。这些数据表明转录因子诱导的重编程可使体细胞表观基因组整体逆转为类ES状态。”(Cell Stem Cell 1：55-70，2007)。

又如，Stadtfeld等人声称：“我们构建了强力霉素诱导的慢病毒系统，用于在成纤维细胞中瞬时表达四个重编程因子c-Myc、Klf4、Oct4和Sox2。”(Cell Stem Cell 2：230-240)。

又如，Nakagawa等人声称：“我们在此描述了不需要Myc逆转录病毒的iPS细胞产生的改进方案。我们使用该方案获得的非iPS背景细胞显著减少，并且产生的iPS细胞始终具有高质量。在研究期间，Myc-iPS细胞来源小鼠不形成肿瘤。该方案也能够有效分离iPS细胞而无需药物选择。此外，我们在无MYC的情况下从成体表皮成纤维细胞产生了人iPS细胞。”(Nature Biotechnology 26：101-106，2008)。

又如，Takahashi等人声称：“我们证明了利用同样的四个因子：Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，可以从成人表皮成纤维细胞产生iPS细胞。”(Cell 131：861-872，2007)。

又如，Okita等人声称：“我们之前的研究显示通过逆转录病毒引入Oct3/4(也称为Pou5f1)、Sox2、c-Myc和Klf4，并随后对Fbx15(也称为Fbxo15)表达进行选择，可从小鼠成纤维细胞诱导多能干细胞。这些诱导型多能干(iPS)细胞(在下文中称为Fbx15 iPS细胞)在形态、增殖和畸胎瘤形成方面与胚胎干(ES)细胞类似；然而，就基因表达和DNA甲基化模式而言它们则不同，而且不能制备成体嵌合体。这里我们得出结论，对Nanog表达进行选择可得到具有生殖系嵌合能力的iPS细胞，与Fbx15 iPS细胞相比，该iPS细胞具有增强的类ES细胞基因表达和DNA甲基化模式。”(Nature 448：313-317，2007)。