[发明专利]细胞及其获得方法

说明书

本发明涉及重编程体细胞、重编程方法、体细胞的重编程因子以及此类因子和细胞的用途。

通过表达4种转录因子(Yamanaka因子)即Oct4、Sox2、c-Myc以及Klf4(1-3)，可以将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)重编程为多能状态。之后应用同一组基因或其变体重编程小鼠(4-6)、大鼠和人(7-9)中的多种谱系的体细胞。将原代体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPS)是复杂且逐渐的过程，伴随着遗传和表观遗传变化(37,51)。因此，4种Yamanaka因子的转基因表达所产生的小鼠iPS克隆经常是异源的，为全部或部分重编程细胞的混合物(52)。iPS细胞自我更新和其他重要的胚胎干细胞(ES)样特性有时需要外源因子的持续表达(51,11)。因此，在无强的选择方案来鉴定完全重编程细胞的情况下，已经证明，通过简单连续传代和亚克隆难以建立种系有活性的(germline-competent)小鼠iPS细胞系。尽管利用基于Yamanaka因子的各种平台，产生了人类iPS细胞，但是可以合理地预测，这些细胞的性质可能也是异源的。因为缺少可靠的报道基因，如连接于内源多能基因的荧光标记或药物选择标记，使得难以从利用可用的重编程因子所产生的人类iPS细胞异源群体中分离完全重编程细胞。

目前来源于胚胎的人类ES细胞，在其形态、基因表达陌生以及集落生成上不同于小鼠ES细胞(53,44)。最明显的差别是，小鼠ES细胞的多能性取决于Jak/Stat3途径通过白血病抑制因子(LIF)的激活(54)或Mek/Erk途径的抑制(40)。相比之下，人类ES细胞不响应LIF，并且仅能通过FGF和活化素维持(44)。最近利用人类ES细胞培养条件衍生了小鼠外胚层干细胞(EpiSC)(55,56)，这表明人类ES细胞在许多方面与小鼠EpiSC类似，而不是与真正的多能小鼠ES细胞类似。目前缺少小鼠ES细胞的真正的人类配对物，这使得难以证明操纵ES细胞多能性的常见范例是否在其他哺乳动物种类中起作用。此外，从应用的观点看，等同于小鼠ES细胞的人类多能干细胞系的有效性，会使得将小鼠ES细胞自我更新、分化以及基因操作的知识财富直接应用于人类ES细胞成为现实。

发明概述

一方面，本发明提供了通过体细胞的核重编程制备诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括使体细胞与核重编程因子[NRF]接触的步骤，所述因子包括下述中的一种或多种：

(i)视黄酸受体(RAR/RXR)家族成员的基因产物，或其激动剂或拮抗剂；

(ii)Lrh1家族成员的基因产物；或其激动剂；

(iii)视黄酸或参与视黄酸的合成或代谢的基因产物；或其激动剂或拮抗剂；

(iv)参与视黄酸家族成员转运的基因产物；

(v)编码上文(i)-(iv)中任一基因产物的多核苷酸(polynucleic acid)。

一方面，所述方法包括使用上文的(i)和(ii)两者。

一方面，本发明涉及将体细胞重编程为诱导多能细胞的方法，包括：

(a)使体细胞与NRF接触，NRF包含或为下述中的一种或多种：

(i)视黄酸受体(RAR/RXR)家族成员的基因产物，或其激动剂；

(ii)Lrh1家族成员的基因产物，或其激动剂；

(iii)视黄酸或参与视黄酸家族成员的合成或代谢的基因产物；或其激动剂或拮抗剂；

(iv)参与视黄酸家族成员转运的基因产物；

(v)编码上文(i)-(iv)中任一基因产物的多核苷酸；

以及

(b)任选地检查或确定所述体细胞是否已经被重编程，以及

(c)使步骤(a)的产物与RA或RAR/RXR家族成员的拮抗剂接触，或消除与NRF的接触，从而维持多能性。

一方面，本发明提供了NRF，其包含下述中的一种或多种：

(i)视黄酸受体(RAR/RXR)家族成员的基因产物，或其激动剂或拮抗剂；

(ii)Lrh1家族成员的基因产物；或其拮抗剂；

(iii)Lrh1家族成员的基因产物；

(iv)视黄酸或参与视黄酸合的成或代谢的基因产物；或其激动剂或拮抗剂；

(v)参与视黄酸家族成员转运的基因产物；

(vi)编码上文(i)-(iv)中任一基因产物的多核苷酸；

一方面，NRF用于将体细胞重编程为诱导多能细胞。