[发明专利]萤火虫荧光素酶、其基因和萤火虫荧光素酶的制造法

说明书

本发明是关于“平成20年度和21年度、独立行政法人科学技术振兴机构、先端计测分析技术·机器开发事业”的委托研究成果所涉及的发明。

技术领域

本发明涉及突变型萤火虫荧光素酶、突变型萤火虫荧光素酶基因、新的重组体DNA和突变型萤火虫荧光素酶的制造法，具体而言，涉及稳定性提高了的萤火虫荧光素酶、其基因和稳定性萤火虫荧光素酶的制造法。

背景技术

萤火虫荧光素酶是在镁离子和氧的存在下将腺苷三磷酸（ATP）、D-荧光素和氧转化为腺苷一磷酸（AMP）、氧化荧光素和二氧化碳并产生光的酶。应用萤火虫荧光素酶的发光原理可以以极高灵敏度测定微量酶反应底物。因此，萤火虫荧光素酶被广泛用于如以ATP为指标的饮食品中的微生物检测、手指和器具类上所附着的食物残渣和污垢的判定，或利用各种抗体技术、基因扩增技术的高灵敏度测定法等。

然而，通常萤火虫荧光素酶等甲虫类荧光素酶对热不稳定，因此具有制成试剂保存时易失活的缺点。此外，通常甲虫类荧光素酶在刚反应后发光量达到顶峰，此后发光量急剧衰减，因此具有难以通过长时间反应进行高灵敏度测定的问题。因此，为克服这一缺点，持续进行尝试以期获得具有良好的发光持续性或稳定性（热稳定性和保存稳定性）、进而期望两者兼备的荧光素酶。

该尝试之一是在配合组成方面下功夫，即，在测定试剂中添加盐等，确保某种程度的发光持续性和保存稳定性。但该方法具有如下缺点：伴随着试剂组成上的各种制约，无法广泛用于各种用途、试剂；此外，多数情况下，盐类的添加容易带来荧光素酶反应某种程度的反应障碍。

在试剂组成方面的其它尝试的更优选方案之一，是探索具有优选性质的突变荧光素酶。并且，在这些尝试之中，已报道了获得了第342位的氨基酸突变成丙氨酸的北美产萤火虫荧光素酶，该萤火虫荧光素酶的发光持续性提高（例如，参照非专利文献1）。此外，申请人获得了相当于该第342位的氨基酸的突变体的平家萤荧光素酶的突变体、即第344位的氨基酸（亮氨酸）突变成丙氨酸的平家萤荧光素酶（以下称为344A荧光素酶），确认了该突变萤火虫荧光素酶发光持续性也同样地提高。但是，另一方面，该突变萤火虫荧光素酶的稳定性与导入突变前相比变得非常低。因此，344A荧光素酶虽然被赋予了发光持续性这一产业上有用的性质，但是由于稳定性极低，以这种现状难以很好地应用于高灵敏度检测等。

综上，在具有优选性质的突变荧光素酶的探索方面，虽然发现了使某一种性质得以提高的突变，但大多观察到该突变反而使其它性质变差。即，即使分别导入多个被认为有用的突变，也难说简单地叠加或协同地赋予这些优选性质，这样的背景使得兼具如发光持续性和稳定性等实用中优选的多个性质的突变荧光素酶的取得变得更加困难。

非专利文献1：Biochemistry 2003年,42卷,p10429-10436

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于，通过对萤火虫荧光素酶基因序列中的特定的碱基导入突变，而提供稳定性优异的萤火虫荧光素酶。进而，课题在于提供一种萤火虫荧光素酶，其即使在与有助于发光持续性等的其它突变组合的情况下，也能够不受损害地发挥稳定性和发光持续性这两个优选的性质。此外，课题在于，对虽然能够获得某种特定优选的效果但其弊端在于降低萤火虫荧光素酶的稳定性的突变，加入进一步的突变，从而提供稳定性的降低获得充分恢复的萤火虫荧光素酶。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题，进行了深入研究，结果发现，将平家萤荧光素酶或源氏萤荧光素酶的第287位的氨基酸置换成丙氨酸的突变（以下称为287A突变）、和将第392位的氨基酸置换成异亮氨酸的突变（以下称为392I突变），分别使萤火虫荧光素酶的稳定性显著提高。并且发现，在将该287A突变和/或392I突变中的任意一者或者将两个突变组合导入到344A荧光素酶中时，显著改善了344A荧光素酶的问题即稳定性低，此外发现，在将这些突变与其它突变进一步组合而导入时，也良好地发挥了稳定性提高效果。进而获知，作为提高344A荧光素酶的低稳定性的其它突变，将第326位的氨基酸置换成丝氨酸的突变（以下称为326S突变）、和将第467位的氨基酸置换成异亮氨酸的突变（以下称为467I突变）组合导入也是有效的，从而完成了发明。即，本发明涉及以下方案。