[发明专利]制备单酰基化多元醇的酶促催化方法

权利要求书

1.制备通式(I)的单酰基化多元醇的生物催化方法：

其中

R₁代表任选取代的线性或分支的饱和或不饱和烃基残基；并且

A代表任选取代的线性或分支的亚烃基残基，其具有至少两个碳原子，

所述方法包括

a)将通式(II)的多元醇与通式(III)的酰基供体化合物在存在突变的三酰基甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)下反应，直至形成上述通式(I)的单酰基化多元醇；

HO-A-OH    (II)

其中R₁和A如上定义，并且

Don代表携带所述酰基基团的供体分子残基；和

b)获得单酰基化多元醇产物。

2.权利要求1的方法，其中所述突变的脂肪酶含有至少一个氨基酸突变，如果与相应的非突变脂肪酶相比，所述突变增加了脂肪酶对所述多元醇的单酰基化的选择性。

3.前述权利要求之一的方法，其中所述突变体包含至少一个突变，其从酶反应中心部分去除了稳定性功能氨基酸，所述稳定性功能氨基酸稳定待形成的通式(I)的单酰基化多元醇的羰基的氧阴离子过渡态。

4.前述权利要求之一的方法，其中

a)获得了最大单酯产量，其比通过相应野生型酶获得的最大产量高至少1%；

b)在这样的多元醇转化率下达到了单酯与聚酯3:1的摩尔比例，所述多元醇的转化率比相应野生型酶获得的相应转化率高至少1%；和/或

c)在多元醇总量的基础上产生90%单酰基化多元醇的反应时间的比例(T₉₀(突变体)/T₉₀(野生型))高于1。

5.前述权利要求之一的方法，其中所述酶是南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的突变体，其包含SEQ ID NO:2的在至少一个位置上发生了突变的氨基酸序列。

6.权利要求5的方法，其中所述突变体包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中氨基酸Thr40发生了突变。

7.权利要求6的方法，其中所述突变使得在氧阴离子中间体与位置40的氨基酸残基之间基本上不会发生稳定化相互作用。

8.权利要求7的方法，其中所述突变包含单突变Thr40Ala、Thr40Val或Thr40Ser。

9.权利要求8的方法，其中所述突变体选自具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的突变体或所述突变体的具有至少60%的序列同一性的变体，所述变体在对应于SEQ ID NO:4的位置Thr40的氨基酸位置上仍然含有突变。

10.权利要求7至9中一项的方法，其中所述突变体额外地在SEQ ID NO:2或4的氨基酸位置Leu 278、Ile 285和Pro 280之一上包含至少一个突变。

11.权利要求10的方法，其中所述突变体和其变体在促成酶的催化位点的其他氨基酸位置中没有发生突变。

12.权利要求11的方法，其中所述突变体在氨基酸位置Ser105、Asp187、His224(催化性三联体)和Gln106上没有发生突变，并且其中所述变体在对应于那些位置的氨基酸位置上没有发生突变。

13.权利要求5至12任何一项的方法，其中在SEQ ID NO:2中或在包含根据SEQ ID NO:4在氨基酸Thr40上突变的SEQ ID NO:2中，Leu278、Ala281、Ala282或Ile285中的一个或多个发生了突变。

14.权利要求13的方法，其中一个或多个突变独立地选自：

Leu278Ser、

Ala281Val或Ala281Glu，和

Ala282Leu、Ala282Thr、Ala282Cys、Ala282Pro、Ala282Ile、Ala282Asp、Ala282Val、Ala282Met或Ala282Arg。