[发明专利]基于DNA疫苗和嵌合体病毒的诱导抗登革热病毒的免疫应答的方法、试剂盒、质粒和组合物

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于DNA疫苗和17D嵌合体病毒的联合免疫或共同施药免疫的诱导抗登革热的免疫应答的方法。在本发明的范围内还包括抗四种登革热亚型的DNA疫苗，其来自包含编码蛋白E的序列、或者仅由相应这个蛋白的区域III的序列的不同的重组质粒的构建，蛋白E来自每个登革热病毒亚型(DENV1-4)。

包含在保护范围内的疫苗组合物包含：

(a)抗四个登革热病毒亚型的DNA疫苗，来自构建的从包含蛋白E基因或包含仅对应于该蛋白区域III的序列的不同的重组质粒，蛋白E来自每个登革热病毒亚型，它们都融合到质粒编码人组织纤溶酶原激活子(t-PA)的信号肽的序列中；

(b)包含由感染克隆粘附技术修饰的黄热病疫苗病毒17D的嵌合体病毒，编码来自不同亚型的登革热病毒的编码蛋白prM和E的序列取代黄热病毒的蛋白prM和蛋白E的序列；

(c)药学上可接受的载体，

本发明还涉及试剂盒，包含(a)来自构建的不同重组质粒抗登革热病毒亚型的DNA疫苗，重组质粒包含编码来自不同登革热病毒亚型的E蛋白的基因，或仅相应于该蛋白区域III的序列，所有这些序列融合到编码人组织纤溶酶原激活子(t-PA)的信号肽的序列中；和(b)包含由感染性克隆粘附技术(infectious clone attainment technology)修饰的黄热病毒疫苗病毒17D的嵌合体病毒，由编码不同亚型的登革热病毒的蛋白prM和E编码的序列替代黄热病毒蛋白prM和E的序列。

背景技术

在由虫媒病毒导致的疾病之中，基于在人群中的致病率和死亡率的重要性，登革热被认为是全球主要公共卫生问题之一，尤其是在热带和亚热带地区。它的致病原是登革热病毒，其是由伊蚊属传播的，通常是由埃及伊蚊传播。

登革热病毒(DENV)属于黄病毒属，黄病毒家族。存在4个从抗原学上和病原学上不同的病毒类型：DENV1、DENV2、DENV3、DENV4。即使由登革热病毒导致的原发感染诱导对感染亚型的免疫，然而并不存在抗其它病毒类型的长期交叉保护，导致不同登革热病毒的继发感染。

登革热病毒是由病毒包膜和复合到RNA分子的核壳组成。它的基因组包含大约10，700核苷酸和由具有阳极的单链RNA组成，其编码黄病毒科蛋白的多肽前体。这个前体由细胞蛋白酶切断，由病毒蛋白酶生长三个结构蛋白，C(壳体)、prM(膜前体)、和E(包膜)，和七个非结构蛋白，NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。该翻译的结构蛋白参与成熟的感染性病毒粒子，其非结构蛋白参与病毒复制和发展。     在绝大多数的黄病毒中，登革热病毒E蛋白(包膜)是被糖基化的结构蛋白和转膜蛋白。这个E蛋白是在这些病毒表面发现的主要糖蛋白成分，具有大约55到60kDa的分子量，由493至501个氨基酸组成。

E蛋白参与大量重要的生物活动。E蛋白作为结合蛋白，与细胞表面的受体结合，介导与宿主细胞膜的病毒膜的融合。这种蛋白还与核包膜相关，在病毒侵入时发挥重要作用。另外，E蛋白是一种强免疫原，在感染病毒的患者体内产生高抗体水平，其可以是中和过程，结合抗原决定簇，其与细胞受体作用，阻止病毒进入宿主细胞(Chang,1997;Kinney & Hung,2001)。

E蛋白是由伸长的平行延伸到病毒膜的二聚体形成。每个单体是由三个域组成：域I、域II和域III。域I是中心部分，由120个氨基酸残基组成：1-51、133-193、279-296。域II是伸长的，包含由分子内部多个点联结的两个单体形成二聚体的区域。区域II包含以下氨基酸残基：52-132、194-280。区域III是位于碳末端的部分，代表免疫球蛋白，它的功能是结合到细胞受体上，比如，存在于未成熟的树状细胞的DC-SIGN。病毒/细胞的结合是通过区域III促进病毒颗粒吞噬作用介导的。区域III包含氨基酸残基：298-394。抗原决定簇在这个区域内能够介导类型和亚类型特异性中和抗体反应。

进行大量的疫苗以对抗登革热，然而，没一个建议的方法代表大量疫苗的所需特性，比如对抗不同的循环病毒亚型的安全和长期的保护免疫反应。

发展疫苗原型的一个主要困难是包含诱导对抗四种登革热病毒亚型的保护性免疫，但不会产生继发后果，例如，出血热以及尽可能使用最低数量或剂量。