[发明专利]新的肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶

权利要求书

1. 一种能够催化α-羟基甘氨酸转化为α-酰胺的分离多肽，其中所述多肽包含含有下述基序1的氨基酸序列：

Xaa₁ Val Xaa₂ Asp Arg Xaa₃ Xaa₄ Xaa₅ Arg Xaa₆ Gln Xaa₇ Xaa₈ Xaa₉ Xaa₁₀ Xaa₁₁ Gly Xaa₁₂ Xaa₁₃ Xaa₁₄ Xaa₁₅ Xaa₁₆ Trp；

其中Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄、Xaa₅、Xaa₆、Xaa₇、Xaa₈、Xaa₉、Xaa₁₀、Xaa₁₁、Xaa₁₂、Xaa₁₃、Xaa₁₄、Xaa₁₅和Xaa₁₆独立选自天然存在氨基酸，条件是Xaa₁和Xaa₇不是Cys。

2. 一种能够催化α-羟基甘氨酸转化为α-酰胺的分离多肽，所述多肽选自：

(a) 包含与SEQ ID NO: 1的氨基酸2-306有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽；

(b) 包含与SEQ ID NO: 2的氨基酸3-336有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽；

(c) 包含与SEQ ID NO: 3的氨基酸3-305有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽；

(d) 包含与SEQ ID NO: 4的氨基酸3-279有至少80%同一性的氨基酸序列的多肽；和

(f) 具有肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶活性的多肽，其特征在于它具有不包含半胱氨酸残基或者包含至多1个或至多2个半胱氨酸残基的氨基酸序列。

3. 一种具有肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶活性的分离多肽，其特征在于它在大肠杆菌中可被表达为可溶性蛋白。

4. 权利要求1-3中任一项的多肽，其包含0、1或2个半胱氨酸残基。

5. 权利要求1-4中任一项的多肽，所述多肽来源于原核生物体。

6. 权利要求1-5中任一项能够催化α-羟基甘氨酸转化为α-酰胺的多肽，其中所述α-羟基甘氨酸是式R-Gly(OH)的C端α-羟基甘氨酸，其中R是肽，Gly(OH)是与所述肽的C端连接的α-羟基甘氨酸残基，和

其中所述α-酰胺具有式R-NH₂。

7. 一种用于产生具有肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶(PAL)活性的酶的方法，其包括以下步骤：

(i) 在适合于酶表达的条件下培养非哺乳动物来源的重组表达宿主细胞，所述宿主细胞包含含有编码酶的核苷酸序列的核酸构建体；和

(ii) 从(a)细胞破碎和离心后的上清液和/或(b)生长培养基中回收酶

其中宿主细胞为非哺乳动物来源，例如大肠杆菌菌株，且其中当在步骤(ii)中回收时，所述酶是可溶的。

8. 权利要求7的方法，其中当在步骤(ii)中回收时，酶是催化活性形式，意指酶不需要重折叠的步骤来获得催化活性。

9. 一种分离多肽，其为可通过权利要求7或8的方法获得的具有肽基-α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶活性的酶，其中所述酶能够催化反应：

R-Gly(OH) →R-NH₂，

其中R是肽，Gly(OH)是与所述肽的C端连接的α-羟基甘氨酸残基。

10. 权利要求9的多肽，其进一步通过权利要求1-6中的任一项表征。