[发明专利]通过酵母生产非酵母的甾醇

说明书

技术领域

本发明涉及在酵母中例如Saccharomyces cerevisiae中生产甾醇，所述甾醇包括7-脱氢胆固醇、25-羟基-7-脱氢胆固醇和25-羟基麦角甾醇。本发明还涉及在酵母中催化酵母甾醇、胆甾-7，24-二烯醇和胆甾-5，7，24-三烯醇的24位置上的双键还原；催化麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、胆甾-8-烯醇和胆甾-7-烯醇的25位置上的羟基化的多种酶。本发明还涉及编码胆固醇C25-羟化酶和甾醇Δ24-还原酶的多种核酸以及它们用来生产并羟基化7-脱氢胆固醇或麦角甾醇的用途。本发明还涉及这样产生的酵母菌株和制造这些甾醇的方法，所述方法包括培养经转化的酵母细胞和收获产生的甾醇(多种)的步骤。

技术背景

酵母中的甾醇途径包括许多步骤。酵母甾醇途径的图表在图14中列出且下面参考它讨论现有技术。

US 5,460,949(Amoco)教导了用于增加角鲨烯和三烯醇在酵母中中累积的方法和组合物。该方法包括在其中基因ERG5和ERG6被失活的菌株中HMG1(调节该途径的单一的最重要的酶)的截短和过表达。ERG5和ERG6编码两种酶活性，所述两种酶活性区别麦角甾醇(酵母和真菌的主要甾醇)生物合成与胆固醇生物合成。这些菌株优选地累积胆甾-5，7，24-三烯醇，其通常是胆固醇生物合成的中间产物。

WO03/064650(Lang等人)(US2006/0240508)公开了在酵母中生产7-脱氢胆固醇和/或生物合成中间产物或随后的产物的方法。这里，来自小鼠和人的C-8甾醇异构酶、C-5甾醇去饱和酶和甾醇Δ24-还原酶的基因在其中ERG5和ERG6被失活并且HMG1基因被截短并过表达的酵母菌株中表达。这些酵母能合成7-脱氢胆固醇。

WO03/064652(Lang等人)(US2006/0088903)公开了通过增加羊毛甾醇-C14-脱甲基酶活性(ERG11)，在转基因的酵母中生产酵母甾醇和/或生物合成中间产物和/或其随后的产物的方法。

WO 2005/121315(Aventis)教导了胆固醇-生产酵母菌株及其用途。来自Arabidopsis thaliana的甾醇Δ7还原酶基因和人甾醇Δ24-还原酶基因被引进其中ERG6被失活和在一些情况下ERG5被失活的酵母宿主菌株中。新菌株能生产与其他中间产物混合的胆固醇。

US 6,562,609(Russel等人)教导了经分离人和小鼠胆固醇C25-羟化酶和基因。

现有技术关于使用转基因的酵母生产25-羟基维生素原D3或25-羟基维生素原D2没有记载。

发明详述

根据本发明已发现，胆固醇C25-羟化酶(其底物通常是胆固醇)可对7-脱氢胆固醇和麦角甾醇起作用，以分别生产25-羟基-7-脱氢胆固醇和25-羟基麦角甾醇。

因而，本发明的一个方面是使用脊椎动物胆固醇C25-羟化酶来羟基化7-脱氢胆固醇或麦角甾醇以分别生产25-羟基-7-脱氢胆固醇(也被称为25-羟基维生素原D3)或25-羟基麦角甾醇(也被称为25-羟基维生素原D2)。

胆固醇C25-羟化酶不是天然存在于酵母中的酶；事实上酵母通常不具有使可能在酵母中存在的7-脱氢胆固醇的侧链羟基化的能力。但是，根据本发明，可制得遗传改良的酵母，通过下述方法将胆甾-5，7，24-三烯醇转化为25-羟基-7-脱氢胆固醇(25-羟基维生素原D3)：

提供具有编码胆固醇C25-羟化酶的核酸的酵母并在使得酵母羟基化7-脱氢胆固醇的条件下培养酵母，

借以生产25-羟基-7-脱氢胆固醇(25-羟基维生素原D3)。

在上述方法中，下述是优选的，酵母已使基因ERG5和ERG6失活且所述酵母还已被提供有编码编码脊椎动物甾醇Δ24-还原酶的核酸，所述脊椎动物甾醇Δ24-还原酶酶已针对酵母中的表达被优化。

还已发现，根据本发明，可制得遗传改良的酵母，通过下述方法将麦角甾醇转化为25-羟基麦角甾醇(也称为25-羟基维生素原D2)：

提供具有编码胆固醇C25-羟化酶的核酸的酵母并在使得酵母羟基化麦角甾醇的条件下培养酵母，

借以生产25-羟基麦角甾醇(25-羟基维生素原D2)。

附图简述

在下述图中，使用了这些缩写词：

TDH3p是TDH3启动子区(来自S.cerevisiae的甘油醛-3-磷酸脱氢酶同工酶3)；

Ori-pBR是来自E.coli的pBR322的ColE1复制起点；