[发明专利]用化学修饰的引物相比于DNA优先扩增mRNA

说明书

发明领域

本发明涉及核酸扩增领域，更具体地，涉及用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的RNA扩增领域。

发明背景

逆转录聚合酶链式反应是一种产生并指数扩增RNA模板的DNA拷贝的方法。在基因表达领域，该方法具有定性和定量的应用。该方法允许检测和测量生物体表达的mRNA的水平。

RT-PCR的主要困难在于基因组DNA对于RNA制备的污染。正如RNA分离试剂和技术的领先的经销商所承认的，大部分RNA分离技术产生的RNA具有相当数量的基因组DNA污染（Ambion，Austin，Tex.，（Life Technologies，Inc.），Technical Bulletin #176 “RT-PCR中避免DNA污染。”）。DNA污染对于RT-PCR尤其有问题，其中最小量的污染DNA都会被指数扩增。一种降低RT-PCR对于DNA扩增的方法涉及用脱氧核糖核酸酶如DNase I对样品进行预处理，见Huang等人，（1996） Biotechniques 20：1012-1020。不幸的是，这种方法不是没有问题。预处理后，必须将DNase失活以防止在RT-PCR期间新生的DNA扩增子的消化。然而，DNAse彻底失活所需的高温会导致RNA模板的降解。作为加热的替代方案，可能用苯酚萃取或用各种从反应混合物中去除DNase的精细和昂贵的试剂化学去除DNase。总之，在RT-PCR中使用DNase是不实用的，因为它需要多个额外步骤，经常威胁脆弱的RNA目标。

由于DNA污染的问题被认为很棘手，已经付出了努力来防止RT-PCR对DNA污染的扩增。一种这样的策略利用了真核基因组DNA中存在内含子。在成熟的mRNA中，缺乏内含子。如果设计在内含子侧翼的引物，从mRNA产生的扩增子将缺乏内含子。然而，从相应的基因组DNA模板中产生的RT-PCR扩增子中包括内含子。如果内含子足够大，将优先扩增较短的mRNA序列（以及随后的cDNA序列），而扩增基因组DNA的效率较低或几乎不扩增（Ambion，Tech. Bull. #176）。在最坏的情形中，基因组DNA和所需的mRNA目标共同扩增，但是两种扩增子可以通过电泳辨别。

不幸的是，引物设计通常不能够克服DNA污染的问题。现在许多PCR测试涉及实时PCR，该技术不包括电泳，但能够在扩增的同时检测核酸，见美国专利No.5，994，056和5，876，930以及相关专利。没有电泳，实时PCR不能够解析出(parse out)相同引物组产生的大小不同的扩增子。检测mRNA目标的任何实时PCR探针也将不可避免地检测相应的基因组DNA污染物。这将不能辨别mRNA及其相应的基因组DNA 。因此，当感兴趣的区域中的内含子太小不能排除基因组DNA的扩增时，可能不能使用实时PCR。

因此，期望创造出一种能保证在RT-PCR期间基因组DNA污染物不与mRNA共同扩增的引物设计的新方法。这种引物设计方法能不论扩增子中内含子的大小而实现mRNA目标的定量扩增。

发明概述

在第一方面，本发明涉及在样品中选择性扩增包含外显子-外显子接头的信使RNA目标的方法，包括步骤：a）将第一寡核苷酸与所述mRNA目标杂交，用至少一种能够RNA-引导合成的酶进行RNA-引导的DNA合成，其中所述第一寡核苷酸包含至少一种在环外氨基基团被修饰的核苷酸，与所述mRNA目标至少部分互补，并在目标中横跨外显子-外显子接头；以及b） 用所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以及至少一种能够DNA-引导的DNA合成的酶扩增步骤 a）的产物；其中所述第二寡核苷酸与所述mRNA目标至少部分互补。也公开了实施本发明的寡核苷酸、反应混合物和试剂盒。

附图简要说明

图1是本发明情境中下文定义的外显子-外显子接头的图示，显示了横跨外显子-外显子接头的引物。

图2为根据本发明的引物设计的图示。

图3显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No：3的扩增曲线。

图4显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No：6的扩增曲线。

图5显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No：7的扩增曲线。

图6显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No：10的扩增曲线。

图7显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No：11的扩增曲线。

图8显示了用本发明的方法中所用的引物SEQ ID No：12的扩增曲线。