[发明专利]由干细胞向肝细胞的分化诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及由胚胎干细胞(以下也称为“ES细胞”)或诱导性多能干细胞(以下也称为“iPS细胞”)等多能干细胞向肝细胞分化诱导的方法。此外，本发明还涉及导入有对于向肝细胞分化诱导有用的基因的干细胞。

本申请要求以参考的形式援引于此的日本申请：日本特愿2009-247342号、日本特愿2010-121282号及日本特愿2010-154225号的优先权。

背景技术

多能干细胞是具有多向分化潜能和自我更新能力的未分化细胞，被揭示在组织损伤后具有组织修复能力。因此，多能干细胞在各种疾病的治疗用物质的筛选、再生医疗领域中是有用的，正在进行积极的研究。多能干细胞中，iPS细胞(Induced Pluripotent Stem Cells，诱导多能干细胞)是通过在成纤维细胞等体细胞中导入特定的转录因子例如OCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC等、使体细胞去分化而制作的诱导性多能干细胞。理论上而言，具有分化万能性(pluripotency)的细胞能够分化诱导为包括肝脏等在内的所有组织、器官。

作为由多能干细胞向肝细胞的分化诱导方法，主要尝试过使其形成细胞聚集体(胚状体)的方法；在培养基中添加体液因子的方法；或者选择适当的细胞外基质、饲养细胞、基质胶等来使用的方法等。但是，据报道，这些方法的培养期间长，分化诱导效率也极低，所得到的肝细胞的药物代谢酶活性也低(非专利文献1～4)。为了提高分化诱导效率，考虑在多能干细胞等中导入对于分化而言重要的基因，但由于尚未建立效率高的基因导入方法，因此几乎没有利用基因导入来诱导肝分化的相关报道。要由干细胞分化为成熟肝细胞，需要由干细胞经过内胚层细胞、肝干细胞、幼稚肝细胞的阶段。各分化阶段中，在培养体系中使用激活素(activin)A、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；basic Fibroblast Growth Factor)、BMP4(bone morphogenetic protein 4，骨形态发生蛋白4)、FGF4、视黄酸或DMSO等体液因子。此外，据报道，作为发生学上能够使其分化为肝细胞的因子，需要HEX、HNF4A、HNF6、FOXA2等转录因子(非专利文献5)。例如，HEX基因在甲状腺、肺、肝脏、血液细胞、血管内皮细胞等中发现了表达。HEX基因缺陷小鼠未发现肝实质细胞，并在出生10.5天(E10.5)前后观察到死亡。认为HEX基因对例如GATA4、HNF4A、FGF受体基因等的表达进行调节。

有文献中提到，在如上所述将发生学上被认为是肝细胞特异性转录因子的FOXA2导入ES细胞中时，虽然观察到部分ES细胞向肝细胞分化，但是也确认到向肝细胞以外的细胞的分化(非专利文献6)。由此可见，FOXA2在导入到ES细胞之类的多能干细胞中时，不能成为可诱导仅向肝细胞分化的转录因子，其作用还未充分明确。

作为下一代基因治疗用载体系统，开发出了使用腺病毒(以下简称“Ad”)的系统。Ad的结构呈由252个壳粒构成的正20面体结构，位于顶点的12个壳粒称为具有突起结构的五邻体(由五邻体基底和纤突构成)，其他240个壳粒称为六邻体。病毒向细胞内的侵入通过纤突与Ad受体(CAR；coxsackievirus-adenovirus receptor，柯萨奇病毒-腺病毒受体)结合、然后五邻体基底的RGD基序与细胞表面上的整合素(αvβ3、αvβ5)结合而发生。但是，在之后的研究中，为了也能够将Ad载体导入未表达CAR或者即使表达CAR其表达量也非常低的细胞中而进行了各种的研究，并公开了研究结果(专利文献1～3)。已有关于使用这种改良型Ad载体向间充质干细胞内传递基因的报道(非专利文献7)。在此，记载了使用各种改良型Ad载体、将基因导入间充质干细胞等的技术方案。但是，间充质干细胞与ES细胞完全不同。此外，该非专利文献中，只不过是公开了Ad载体具有能够将基因导入到细胞中的DDS(Drug Delivery System，药物传递系统)的作用。有报道称腺病毒载体能够作为小鼠ES或iPS细胞的分化工具使用(非专利文献8、9)。但是，这些非专利文献中并没有公开由干细胞向肝细胞分化诱导的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2002-272480号公报(日本专利第3635462号公报)

专利文献2：日本特开2003-250566号公报

专利文献3：日本特开2008-136381号公报

非专利文献

非专利文献1：Genes to Cells，13，731-746(2008)