[发明专利]诱变方法

权利要求书

1. 一种诱变核酸分子的方法，所述方法包括下述步骤：

a）提供模板，所述模板包含在环状DNA载体中的靶核酸分子，

b）提供至少一种诱变引物，其含有要导入靶核酸分子中的突变，

c）使所述诱变引物与靶核酸分子退火，

d）进行引物延伸和连接反应，以形成双链的异源双链体，其中一条链是模板链，另一条链是新合成的突变链，

e）使模板链不适于滚环扩增（RCA），

f）通过多次引发的滚环扩增来扩增所述突变链，和

g）将扩增的DNA转化至合适的宿主中。

2. 根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在步骤f）和g）之间的额外步骤，其中所述扩增的DNA通过下述方法转化成质粒大小的单位：（i）用限制性酶消化，（ii）用限制性酶消化和用DNA连接酶连接，或（iii）通过重组。

3. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤a）的模板含有尿嘧啶，且在步骤e）中，通过尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）处理，使所述模板链不适于RCA。

4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述模板是从ung-/dut- 大肠杆菌株得到。

5. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤a）的模板是甲基化的且尿苷酸化的dsDNA，在步骤e）中通过UDG和DpnI限制性酶处理使模板dsDNA不适于RCA。

6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述模板是从dam+/ung-/dut- 大肠杆菌株得到。

7. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤a）的模板含有甲基，且在步骤e）中，通过限制性酶处理使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够消化甲基化的DNA，但是不能消化未甲基化的DNA。

8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述限制性酶是DpnI。

9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述模板是从dam+ 大肠杆菌株得到。

10. 根据权利要求1所述的方法，其中在有甲基化剂存在下进行步骤d）的引物延伸反应，且在步骤e）中通过限制性酶处理使所述模板链不适于RCA，所述限制性酶能够使未甲基化的链产生切口，并使甲基化的链保持完整。

11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述限制性酶选自MspI和HaeIII。

12. 根据权利要求10所述的方法，其中所述模板是从dam- 大肠杆菌株得到。

13. 根据权利要求10-12中任一项所述的方法，所述方法另外包括：在用限制性酶进行所述处理以后，用外切核酸酶处理。

14. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤e）中，通过用仅在模板链中具有识别位点的产生切口的内切核酸酶处理，使所述模板链不适于RCA。

15. 根据权利要求14所述的方法，所述方法另外包括：在产生切口的内切核酸酶处理以后，用外切核酸酶处理。

16. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述诱变引物含有至少一个定点突变。

17. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述诱变引物含有至少一个随机突变。

18. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中用phi29 DNA聚合酶进行所述滚环扩增。

19. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中在产生随机突变的条件下进行所述滚环扩增。

20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述条件选自：减少模板量、给滚环扩增补充MnCl₂和给滚环扩增补充三磷酸核苷酸类似物。

21. 根据前述任一项权利要求所述的方法，其中要诱变的核酸分子是双链DNA的形式，且所述方法包括：在步骤c）之前，打开所述双链结构。