[发明专利]用于消化鸡胚胎的酶组合物

说明书

技术领域

本发明涉及病毒生产领域。本发明特别涉及酶组合物，其用于消化鸡胚胎以制备用于产生病毒的细胞。

发明背景

大多数病毒疫苗如减毒或重组病毒是从原代或次级鸡细胞如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)、鸡胚胎肾细胞(CEKC)或者鸡胚胎肝细胞(CELC)中产生的。原代CEF特别用于如下病毒疫苗的生产：日本脑炎病毒疫苗(由例如Pasteur Merieux生产)、黄热病病毒疫苗(由例如Arilvax生产)、流感病毒疫苗(由例如Medeva Pharmaceuticals生产)、麻疹和风疹病毒疫苗(由例如Merck生产)及改良的安卡拉痘苗病毒(modified Vaccinia Virus Ankara,MVA)疫苗。

已经公开了从原代组织中产生细胞制备物的一些方法。这些方法包括使用机械解离、酶解离或者组合这两种方式。机械解离包括例如用手术刀刮擦、切碎胚胎或者物理性切割胚胎。过度的机械解离通常导致大量细胞死亡和细胞破坏。此外，某些机械解离方案的手工操作性质(例如手工粉碎)通常由于个体之间解离效率的不同而导致难以对比不同来源的测量值(如细胞存活力)。事实上，这种方法的手工操作形式可导致两个相同样品之间的物理性状差异(例如细胞浓度、细胞存活力、细胞大小分布)。在避免机械解离的不利影响的尝试中，使用来自牛胰腺的胰蛋白酶。遗憾的是来自牛胰腺的胰蛋白酶可含有病原性物质如病毒。因此存在潜在的风险，即这些病原性物质被传播至用所述疫苗治疗或接种的动物或人。与通常使用来自牛胰腺的胰蛋白酶相关的一个主要问题是可能将导致牛海绵状脑病(BSE)的物质传播至与从细胞培养物中产生的产物接触的动物或人。由此已经公开了用于从原代或次级细胞中产生疫苗的重组胰蛋白酶。

国际专利申请WO 2004/022729描述了在原代CEF上扩增痘病毒的方法，其中所述CEF得自用预温的(37℃)胰蛋白酶-EDTA溶液在存在无血清培养基及在室温条件下处理15分钟的鸡胚胎。

国际专利申请WO 2006/116803描述了从哺乳动物胚胎中产生干细胞的方法，其中所述胚胎根据其大小可以在预温的胰蛋白酶溶液中浸泡5-60分钟。

从原代鸡细胞中产生疫苗的一个主要问题是要提供足够量的鸡胚胎。为了减少所需鸡胚胎的数目，需要这样的酶组合物，其可以获得由从每个胚胎提取的最大数量细胞组成的细胞制备物。本发明提供了这种组合物。本发明更特别提供了用于消化鸡胚胎的酶组合物，以获得由从每个胚胎中提取的超过50010⁶个细胞组成的细胞制备物。此外，本发明的酶组合物能消化未经预先解剖的鸡胚。

发明揭示

如在本申请中所用，除非特别指出，在提及成分或步骤时所用术语“一个”的含义是指“至少一个”、“至少第一个”、“一或多个”或者“多个”。

如在本申请中所用，“和/或”包括“和”、“或”及“该术语关联的要素的所有或任何其它组合”。

如在本申请中所用，“包含”是指所述产物、组合物和方法包括提及的成分或步骤，但是不排除其它成分或步骤。“基本由…组成”在用于定义产物、组合物和方法时，应是指排除任何实质意义的其它成分或步骤。因此，基本由指定成分组成的组合物不排除微量的污染物和药物可接受的载体。“由…组成”应是指不包括微量的其它成分或步骤。

如在本申请中所用，“大约”是指在指定值或范围的20%以内，优选在10%以内，更优选在5%以内。

本发明涉及用于消化鸡胚胎以制备细胞的酶组合物。根据一个特别的实施方案，所述细胞可用于产生病毒。

本发明更特别涉及酶组合物在消化鸡胚胎以获得鸡细胞制备物中的用途。

本发明的酶组合物令人惊奇地使得可以获得基本上由从每个胚胎中提取的超过50010⁶个细胞组成的鸡细胞制备物。关于这方面，本发明更特别涉及这样的酶组合物，其消化鸡胚以获得基本上由从每个胚胎中提取的超过50010⁶个细胞组成的鸡细胞制备物。

本发明的酶组合物包含至少2种酶。本发明组合物中包含的酶选自由以下所组成的组：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、分散酶、胶原酶、accutase、嗜热菌蛋白酶、链霉蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、神经氨酸酶和胰酶制剂(pancreatin)。本发明组合物中包含的酶优选选自由以下所组成的组：胰蛋白酶、分散酶、胶原酶和accutase。关于这方面，本发明更特别涉及用于消化鸡胚胎的酶组合物，其中所述酶组合物包含选自由胰蛋白酶、分散酶、胶原酶和accutase组成的组的至少2种酶。