[发明专利]人胚胎干细胞的分化

说明书

本发明提供促进多能干细胞分化为胰岛素产生细胞的方法。具体而言，本发明提供一种使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加的方法。

技术领域

本申请要求2009年12月23日提交的美国临时申请No.61/289,692的 优先权，该申请通过引用的方式完整并入本文。

技术领域

本发明提供促进多能干细胞分化为胰岛素产生细胞的方法。具体而 言，本发明提供一种使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3 和NKX6.1的表达增加的方法。

背景技术

用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注 意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素产生细胞或β细胞的来源上。一种 方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。

在脊椎动物的胚胎发育期间，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程 中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状 腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而 来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标 志物，如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。

定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰- 十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后 不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了 其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分 泌组织来自胰腺内胚层的分化。

据报道，从小鼠的胚胎细胞体外衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。 例如，Lumelsky等人(Science(科学)292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干 细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes(糖尿 病)49：157，2000)报道，从小鼠胚胎干细胞衍生的胰岛素分泌细胞在植入 链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠时使血糖正常。

在一个实例中，Hori等人(PNAS(美国国家科学院院报)99：16105， 2002)公开了用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞 产生了与β细胞相似的细胞。

在另一个实例中，Blyszczuk等人(PNAS(美国国家科学院院报) 100：998，2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞生成产生胰岛 素的细胞。

Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰 腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4 天的培养物中时视黄酸是诱导PDX1表达最有效的(Diabetes(糖尿病) 54：301，2005)。

Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表 明，外源Pdx1表达明显增强了所得到的分化细胞中胰岛素、促生长素抑制 素、葡萄糖激酶、神经元素(neurogenin)3、p48、Pax6和HNF6的表达 (Diabetes(糖尿病)53：1030，2004)。

Skoudy等人报道说，活化素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚 胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛 素和胰高血糖素)的表达。使用1nM活化素A时观察到了最大的效果。他 们还观察到胰岛素和Pdx1 mRNA的表达水平未受视黄酸影响；然而，3nM FGF7处理导致了Pdx1转录物的水平增加(Biochem.J.(生物化学月刊)379： 749，2004)。

Shiraki等人研究了能特征性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生 长因子的效果。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细 胞(GenesCells.2005Jun；10(6)：503-16.)。