[发明专利]用于处理纤维素材料的方法和适用于该方法的CBHII/CEL6A酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用真菌CBHII/Cel6A纤维二糖水解酶或含有所述酶的酶制剂来处理纤维素材料的方法。所述酶适用于各种工业用途，特别适用于生物燃料的生产，其中可有利地在中到高温的范围内从木质纤维材料中生产可发酵糖。本发明还涉及真菌CBHII/Cel6A多肽以及编码所述酶的独立的核酸分子、重组载体、生产所述酶的宿主细胞、含有所述酶的酶组合物，以及这些组合物的制备方法。本发明还涉及所述酶或酶组合物的各种应用，其中需要对纤维素或木质纤维材料进行酶转化。

背景技术

有限的化石燃料资源、由其释放出的越来越多的二氧化碳以及所引起的温室现象提出了使用生物质作为可再生和清洁能源的需求。一种有希望的替代技术是生物燃料的生产，如从纤维素材料中制备乙醇、丁醇或丙醇。在运输领域中，生物燃料暂时是唯一的选择，其能够将二氧化碳排放量减少一个数量级。乙醇可以用于现有的车辆和分布系统，因此不需要昂贵的基础设施投资。源自纤维素和木质纤维可再生原料的糖还可以用作用于可取代石油基化学品的各种化学产品的原料。

植物中的大多数碳水化合物以木质纤维素的形式存在，其实质上是由纤维素、半纤维素和木质素组成。在传统的由木质纤维素生产乙醇的方法中，木质纤维材料首先进行化学或物理的预处理，使用酸水解、蒸汽爆破、氨纤维膨胀、碱性湿态氧化或臭氧预处理，以使纤维素成分更易于酶解。然后，纤维素成分被水解后，获得可以通过酵母发酵成乙醇再蒸馏而获得纯乙醇的糖。木质素是作为可以用作固体燃料的主要副产品而获得的。在这种单独的水解和发酵(SHF)过程中，酶水解温度一般高于发酵温度。水解过程中使用耐热酶提供了潜在优点，如在高温体下的较高反应速率，由于较高的比活和酶寿命而减少酶的用量，增大了流程配置和更好的卫生方面的灵活性。

为使生物乙醇生产过程更加经济而进行了持续的研究。其中一种选择是同步糖化和发酵(SSF)法。其主要优点是降低酶水解的终产物抑制，并减少了投资成本。其挑战是寻找酶水解和发酵的有利条件，例如温度和pH值。在综合生物过程(CBP)中，外部添加的酶量可以通过利用能够产生一组木质纤维素酶的发酵生物质或生物乙醇而大大减少。

近年来，用于乙醇生产的微生物代谢工程已取得重大进展。除了酿酒酵母外，微生物如细菌属发酵单胞菌和大肠杆菌以及酵母如树干毕赤酵母、脆壁克鲁维酵母已经被确定可用于从纤维素中制备乙醇。在SSF法中，抑制剂和耐热性以及利用多种糖的能力都是发酵微生物的重要特性。已经开发的工程酵母菌除葡萄糖外还能够发酵戊糖、木糖和阿拉伯糖。嗜热微生物如解糖热厌氧杆菌或热纤梭菌已经用于在50～60℃的高温条件下将糖、包括木糖发酵成乙醇（嗜热SSF或TSSF）。这种发酵生物质也有用于CBP的潜力（Shaw等人，2008）。

酶水解被认为是用于将纤维素生物质转化为可发酵糖的最有前途的技术。然而，酶水解仅用于有限数量的工业规模，尤其是在使用高度木质化的材料如木材或农业废弃物时，该技术并不令人满意。已经进行了提高纤维素材料的酶水解效率的工作（Badger，2002；Kurabi等人，2005）。

WO2001060752（丹麦Forskningscenter）公开了一种将固体木质纤维素生物质转化为可燃性燃料产品的连续式方法。在用湿法氧化或蒸汽爆破进行预处理后，生物质被部分地分为纤维素、半纤维素和木质素，然后再使用一种或多种糖酶进行部分水解(EC3.2)。

WO2002024882（加拿大Iogen Bio-Products公司）涉及一种通过采用含有纤维素酶和利用灭活其纤维素接合域(CBD)获得的改性纤维二糖水解酶I(CBHI)的酶混合物对经预处理的木质纤维基质进行处理来将纤维素转化为葡萄糖的方法。US2004/0005674（美国Athenix公司）公开了可以直接用于木质纤维素基质的新型的酶混合物。协同酶混合物包含纤维素酶，以及诸如纤维素酶、木聚糖酶、木质酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡萄糖苷酸酶或其任何组合的辅助酶。纤维素酶被视为包括内切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG)和纤维二糖水解酶(CBH)。US20050164355（美国Novozymes Biotech公司）公开了一种采用一种或多种选自EG、BG和CBH的纤维素分解酶在至少一种表面活性剂存在的条件下降解纤维素材料的方法。也可以使用其他的酶，如半纤维素酶、酯酶、过氧化物酶、蛋白酶、漆酶或其混合物。

研究最多、应用最广泛的真菌来源的纤维素分解酶源自里氏木霉（无性型红褐肉座菌）。已有源自更不为人所知的真菌的纤维素酶被公开。