[发明专利]在缺乏二肽基氨肽酶活性的巴斯德毕赤酵母中生产治疗性蛋白的方法

权利要求书

1.一种在酵母宿主细胞中产生重组蛋白的方法，其中所述宿主酵母细胞缺乏二肽基氨肽酶（DAP）活性，所述方法包括：a. 用编码蛋白的多核苷酸载体转化其中DAP活性已经被去除的基因修饰的酵母细胞；b. 在诱导蛋白表达的条件下在培养基中培养被转化的宿主细胞；和c. 从转化的宿主细胞或培养基中分离蛋白。

2.权利要求1的方法，其中酵母细胞是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。

3.权利要求1或2的方法，其中通过从酵母细胞基因组中删除或破坏STE 13和DAP2基因而去除DAP活性。

4.权利要求1的酵母，其中宿主细胞已经被基因工程化以产生包含人样N-聚糖的糖蛋白。

5.权利要求4的酵母，其中人样N-聚糖选自杂合和复合的N-聚糖。

6.权利要求1的酵母，其中宿主细胞被基因工程化以产生主要具有N-聚糖的糖蛋白，所述N-聚糖选自Man₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂、Gal_(1-4）G1cNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂和 NANA_（1-4）Gal_（1-4）GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂。

7.权利要求1的方法，其中酵母进一步表达人糖蛋白。

8.一种缺乏二肽基氨肽酶（DAP）活性的基因修饰的酵母细胞，包括其中编码STE13和DAP2的基因组DNA已被从酵母细胞基因组中删除或破坏的酵母细胞系。

9.权利要求8的酵母细胞，其中酵母细胞是巴斯德毕赤酵母。

10.权利要求6的方法，其中宿主细胞已被基因工程化以产生包含人样N-聚糖的糖蛋白。

11.权利要求10的方法，其中人样N-聚糖选自杂合和复合的N-聚糖。

12.权利要求6的方法，其中宿主细胞被基因工程化以产生主要具有N-聚糖的糖蛋白，所述N-聚糖选自Man₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂、GlcNAcMan₃GlcNAc₂、GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂、Gal_（1-4）GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂和NANA_（1-4）Gal_（1-4）GlcNAc_（1-4）Man₃GlcNAc₂。

13.权利要求6的方法，其中所述蛋白是人糖蛋白。

14.一种在酵母细胞中产生具有N-末端识别位点Xaa-Pro或Xaa-Ala的治疗性蛋白的方法，其中Xaa代表任何一种氨基酸，所述方法包括：a. 用编码具有选自Xaa-Pro和Xaa-Ala的N-末端识别位点的治疗性蛋白的多核苷酸载体转化其中DAP活性已经被去除的基因修饰的酵母细胞；b. 在诱导治疗性蛋白表达的条件下培养被转化的宿主细胞；以及c. 从转化的宿主细胞中分离治疗性蛋白。