[发明专利]定量核酸酶保护测序(qNPS)

说明书

本发明在广义上涉及用于在核酸靶标的鉴定和检测中进行定量核酸酶保护测序(qNPS)的组合物和方法。更具体地，本发明提供了用于使用测序来分析来自生物样本的核酸的组合物和方法。

本发明提供了一种用于解决测序面临的几个难题并改善了研究和诊断应用的新方法——定量核酸酶保护测序(qNPS^TM)。所述方法使用仅需样本裂解的核酸酶保护测定来产生用于测序的DNA（或其他合成的）探针，所述探针自身可被测序，或者偶联于(a)基因特异性标签从而鉴定基因而不必对所述核酸酶保护探针自身测序，和/或(b)实验特异性标签从而可将来自不同患者的样本合并到单次运行中。所公开的qNPS作为一种研究和发现工具以及作为诊断测试使得对固定或不溶的样本以及其他样本的测序成为可能且费用较低。

还公开了用于在当前系统（例如454、Solexa、SOLID）和下一代平台（例如单分子测序）上测序的方法。qNPS提供了目标明确的或者有针对性的用于研究和诊断的测序能力，例如：i)成本低/样本少；ii)高样本通量；iii)减少测序运行时间并简化数据分析；iv)允许靶标基因的高效测序而无来自其他基因（例如来自宿主的病原体的基因）的背景干扰；v)提供精确方式来测量基因表达、表达的单核苷酸多态性(SNP)、DNA SNP、DNA甲基化、rRNA、miRNA、突变等的特征集，这些可用作生物标记；vi)使得能够从所有样本类型测序，特别是从固定的例如福尔马林固定的组织或者固定的细胞内染色并分选的样本测序；以及vii)将被测序的样本的复杂程度从全基因大大简化到仅核酸酶保护探针或由所述探针保护的靶标序列。

动物组织和临床样本通常通过以石蜡包埋的福尔马林固定(FFPE)的组织的形式的固定进行保存。因此，组织基因表达和DNA的商业可行的诊断测定必须能够使用FFPE。此外，几百万这类样本在临床中心和医院存档，并且对应的治疗形式和临床结果是已知的。因此，FFPE样本代表了用于快速和高效鉴定诊断生物标记并藉此开发和验证预后和诊断测定的珍贵资源。

用于研究和诊断应用的测序面临几个难题。所公开的定量核酸酶保护测序(qNPS)方法使用仅涉及裂解方式的核酸酶保护测定来产生用于测序的探针（例如DNA探针），其可被直接测序，或者可偶联于例如(i)基因特异性标签从而使得可鉴定所测量的基因序列而无需对所述核酸酶保护探针自身测序，和/或(ii)实验特异性标签——一种对于每个独立样本都是独特的标签，从而使得不同样本（例如来自不同患者或来自不同治疗或实验的样本）可合并到单次测序运行中但在测序后仍可被区分。qNPS提供了诸如以下的测序能力：i)成本低/样本少；ii)高样本通量；iii)减少测序运行时间并简化数据分析；iv)允许靶标基因的高效测序而无非靶标基因或基因序列的背景干扰，包括例如无宿主组织基因组干扰的宿主组织的病原体基因或者移植组织的测序；v)提供精确方式来测量基因表达、表达的单核苷酸多态性(SNP)、DNA SNP、DNA甲基化、所有RNA包括miRNA、rRNA、突变或其他核苷酸靶标等的特征集，这些可用作生物标记；vi)使得能够从所有样本测序，所述样本包括特别是固定的组织，例如福尔马林固定的组织或者苏木素-伊红(H&E)染色的组织或者戊二醛固定的组织，如固定的细胞内染色并分选的细胞；以及vii)将被测序的样本的复杂程度从全基因大大简化到仅核酸酶保护探针。