[发明专利]新颖的甘露聚糖酶变体

说明书

发明领域

本文提供的技术涉及微生物甘露聚糖酶的经改进的变体，更具体地，涉及展示出甘露聚糖酶活性作为其主要酶活性的微生物酶；涉及编码所述甘露聚糖酶的核酸分子，含有所述核酸的载体、宿主细胞，以及生产甘露聚糖酶的方法；包含所述甘露聚糖酶的组合物；用于制备和生产此类酶的方法；以及涉及使用此类酶用于食品和饲料加工，用于咖啡萃取和咖啡废料加工，作为食品和饲料的补充剂，用于纸浆的酶辅助漂白，在纺织工业中作为漂白和/或脱浆剂，用于通过水力压裂(hydraulic fracturing)进行油井和气井增产(oil and gas well)，作为去垢剂，作为烘焙成分，用于除去生物膜以及用于递送系统中，用于谷粒加工，或用于用以生产生物燃料的可再生资源的加工，以及用于纺织、探油、清洁、洗涤、去垢剂以及纤维素纤维加工工业的方法。

发明背景

内-β-1，4-D-甘露聚糖酶(β-甘露聚糖酶；EC 3.2.1.78)在基于甘露聚糖的多糖中催化甘露糖苷键的随机水解。大多数β-甘露聚糖酶将寡糖降解为DP4(Biely和Tenkanen(1998)Enzymology of hemicellulose degradation，页25-47，在Harman和Kubiceck(ed)Trichoderma and Gliocladium，卷2，Taylor和Francis Ltd.London中)，但是，其已在甘露三糖上显示出残余活性，这指示了针对甘露糖结合在蛋白质上的至少四个亚位点。水解的主要终产物通常是甘露二糖和甘露三糖，虽然也产生显著量的甘露糖。一些β-甘露聚糖酶能降解结晶甘露聚糖。除水解外，若干β-甘露聚糖酶(包括来自里氏木霉的β-甘露聚糖酶)已显示出作为糖苷键受体的甘露糖或甘露二糖形成转糖苷产物。

β-甘露聚糖酶已分离自多种广泛的生物，包括细菌、真菌、植物和动物。虽然大多是细胞外的，一些β-甘露聚糖酶看起来是与细胞关联的。它们的表达通常是在甘露聚糖或半乳甘露聚糖上的生长所诱导的，但是，来自里氏木霉的β-甘露聚糖酶还可被纤维素诱导，虽然其表达被葡萄糖和其它单糖遏制。经常在相同生物中发现具有不同等电点的多种甘露聚糖酶，它们分别代表了来自不同基因的产物或来自相同基因的不同产物。

通常，β-甘露聚糖酶具有40℃至70℃之间的温和的温度最优值，除了来自嗜热生物的一些β-甘露聚糖酶(Politz等人(2000)A highly thermostable endo-1，4-β-mannanase from the marine bacterium Rhodothermus marinus；Appl.Microbiol.Biotechnol.53：715-721)。pH最优值在中性或酸性区中，例如对于来自里氏木霉的β-甘露聚糖酶而言pH5.0(Arisan-Atac等人(1993)Purification and characterisation of a β-mannanase of Trichoderma reesei C-30；Appl.Microbiol.Biotechnol.39：58-62)。酶的分子量在30kD和80kD的范围内。

WO 002008009673公开了里氏木霉甘露聚糖酶的变体，其改进了热稳定性和低pH/胃蛋白酶抗性，以用于水解含有半乳甘露聚糖的植物材料(例如，棕榈仁渣(palm kernel expeller，PKE))以及用于动物饲料。

例如，热稳定性是在包含高温的造粒流程之前掺入饲料混合物中的饲料添加剂所需要的。此外，作为饲料添加剂应用的甘露聚糖酶需要是低pH稳定和胃蛋白酶稳定的，其必须在低pH下具有活性，以在(例如单胃动物的)胃中高效工作。

但是，在饲料工业中的趋势是日益增加造粒温度。目前，目标是在90℃至95℃造粒温度左右的酶稳定性，以使得能在所有工业相关的饲料生产车间使用酶。因此，具有改进的热稳定性的甘露聚糖酶的可用性将是高度有利的，因为其允许在具有高操作温度的车间中也使用该酶。

发明内容

在第一个方面，本文公开内容的实施方式提供了甘露聚糖酶变体，其具有与亲本/野生型里氏木霉甘露聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)不同的氨基酸序列，并且具有一种或多种有利的性质。此类性质可包括但不限于：有益的：热稳定性；温度/活性曲线；pH/活性曲线；比活性；以及pH/蛋白酶-敏感性。