[发明专利]生产重链抗体的小鼠

说明书

发明领域

本发明的领域为生产重链抗体的遗传修饰的非人动物，尤其是在其编码免疫球蛋白γ（IgG）基因的CH1结构域（或CH1结构域及铰链区）的序列内包含核苷酸序列删除却能够表达不缺少功能性CH1结构域的IgM的遗传修饰的非人动物，具体而言为能够产生野生型IgM分子（即，具有CH1结构域）但产生不含功能性CH1结构域（或CH1结构域以及铰链区）的重链IgG抗体的小鼠。

发明背景

在大多数动物中，正常的免疫球蛋白重链只在与其同源轻链相偶联时会有很好的表达。在人类中，单独的重链发现于重链疾病中，这些疾病的表征为重链功能失调，其缺少可变重链、CH1或可变重链及CH1结构域的序列。不含轻链的重链可见于鱼的特定物种以及骆驼中。这些重链缺少功能性CH1结构域并且在其重链可变结构域中具有非人的特征。已有人尝试通过修饰小鼠以表达模拟骆驼或鱼的特定物种中发现的VHH结构域的骆驼化基因而产生骆驼化抗体，部分地通过移除IgM和IgG的CH1结构域并使重链可变区的构象变为与骆驼和/或特定鱼物种类似。然而，预期骆驼化抗体可诱导非骆驼动物中产生免疫应答。

本领域有对遗传修饰的非人动物的需要，其可用于产生具有非骆驼VH结构域的重链抗体。

附图简述

图1示例说明了小鼠中的野生型IgG1基因座（locus）（IgG1，上图），显示了JH区域基因片段，其融合至CH1基因片段，其后为铰链区域、CH2基因片段及CH3基因片段；由删除CH1结构域的构建体靶向的IgG1位点（IgG1ΔCH1，中图）；由删除CH1结构域及铰链区域的构建体靶向的IgG1位点（IgG1ΔCH1-Δhinge，下图）。

图2示例说明了靶向小鼠IgG1基因以产生表达缺少CH1结构域的IgG1的经遗传修饰的基因座。

图3示例说明了靶向小鼠IgG1基因以产生表达缺少CH1结构域并缺少铰链区域的IgG1的经遗传修饰的基因座。

图4示例说明了靶向小鼠重链恒定区基因座以产生表达缺少CH1结构域的IgG1而不表达IgG2b或IgG2a的经遗传修饰的基因座。

图5示例说明了由删除CH1结构域并删除铰链区且删除IgG2b基因及IgG2a基因的构建体靶向的小鼠重链恒定区。

图6示例说明了经遗传修饰的小鼠的重链恒定区，其具有缺少CH1结构域或缺少CH1结构域和铰链区的IgG1（上图），以及经遗传修饰的小鼠的重链恒定区，其具有缺少CH1结构域或缺少CH1结构域和铰链区的IgG1，且其缺少IgG2a基因并缺少IgG2b基因（下图）。

图7显示了对不同CHO细胞上清进行的Western印迹，其中CHO细胞分别经工程改造为独立地表达：对照（与小鼠Fc融合的细胞因子胞外域）、缺少CH1结构域的嵌合（人VR）/（小鼠Fc）重链抗体（hVR-mFcΔCH1）、缺少CH1结构域的骆驼化嵌合（人VR）/（小鼠Fc）重链抗体（hVR*-mFcΔCH1）、嵌合（人VR）/（小鼠Fc）重链抗体（hVR-mFc）、骆驼化嵌合（人VR）/（小鼠Fc）重链抗体（hVR*-mFc）、具有或不具有CH1结构域的mFc（分别为mFc和mFcΔCH1）。

图8显示了用抗小鼠IgG对来自野生型小鼠（左）及来自IgG1缺少CH1结构域且缺少铰链区的经遗传修饰的小鼠（杂合，右）的小鼠血清进行的还原性SDS-PAGE的Western印迹图像；提供了重链以及分子量标志物位置的示意图。

图9显示了来自野生型小鼠（WT）及来自四只IgG1缺少CH1结构域且缺少铰链区的经遗传修饰的小鼠（纯合；分别标记为HO 1、HO 2、HO 3、HO 4）的小鼠血清进行的非还原性SDS-PAGE的Western印迹图像，用抗小鼠IgG进行印迹；每只小鼠（WT或HO）都有两条泳道，泳道以上方的括号表示对应着每只动物血清的1:5及1:10稀释样品（对每只动物为从左到右的连续泳道）。

图10提供了正常IgG1抗体（左）及缺少CH1结构域并缺少铰链区的重链抗体的示意图。

图11显示了对野生型小鼠（WT）及包含缺少CH1结构域并缺少铰链区的IgG1的经遗传修饰的小鼠（HO；表达缺少CH1结构域并缺少铰链区的重链抗体的纯合小鼠）分别进行IgG1和IgG2b血清免疫球蛋白测定。对照为混合的人血清。