[发明专利]优化的内切核酸酶及其用途

权利要求书

1.优化的内切核酸酶，其由下述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:1、2或15所描述的氨基酸序列但是通过缺失SEQ ID NO:1、2或15中所示的内切核酸酶的C末端的氨基酸序列TISSETFLK的1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸而不具有所述氨基酸序列TISSETFLK。

2.权利要求1所述的优化的内切核酸酶，其氨基酸序列由SEQ ID NO:3所描述的氨基酸序列组成。

3.优化的内切核酸酶，其氨基酸序列由SEQ ID NO:5所描述的氨基酸序列组成。

4.权利要求1或3所述的优化的内切核酸酶，其是经改造的内切核酸酶。

5.权利要求1至3的任一项所述的优化的内切核酸酶，其与至少一个锌指结构域，或至少一个源自转录激活物-样(TAL)效应子的重复单元，或至少一个锌指结构域和至少一个源自转录激活物-样(TAL)效应子的重复单元融合。

6.权利要求4所述的优化的内切核酸酶，其与至少一个锌指结构域，或至少一个源自转录激活物-样(TAL)效应子的重复单元，或至少一个锌指结构域和至少一个源自转录激活物-样(TAL)效应子的重复单元融合。

7.权利要求1至3和6的任一项所述的优化的内切核酸酶，其还包含SecIII或SecIV分泌信号。

8.权利要求4所述的优化的内切核酸酶，其还包含SecIII或SecIV分泌信号。

9.权利要求5所述的优化的内切核酸酶，其还包含SecIII或SecIV分泌信号。

10.包含多核苷酸序列的经分离的多核苷酸，所述多核苷酸序列编码权利要求1至9中任意一项所述的优化的内切核酸酶。

11.权利要求10所述的包含核苷酸序列的经分离的多核苷酸，其中经分离的多核苷酸的序列：

a.是经密码子优化的，

b.具有低含量的RNA不稳定性基序，

c.具有低含量的密码子重复，

d.具有低含量的隐蔽剪接位点，

e.具有低含量的备选起始密码子，

f.具有低含量的限制性位点，

g.具有低含量的RNA二级结构，

h.具有a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)的任何组合。

12.表达盒，所述表达盒包含与启动子和终止子序列功能性组合的、权利要求10或11所述的经分离的多核苷酸。

13.载体或宿主细胞，其包含：

a.编码权利要求1至9中任一所述的优化的内切核酸酶的多核苷酸，或

b.权利要求10或11所述的经分离的多核苷酸，或

c.权利要求12所述的表达盒，或

d.a)、b)和c)的任何组合。

14.权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是农杆菌细胞。

15.用于多核苷酸同源重组的方法，其包括：

a.提供用于同源重组的感受态细胞，

b.提供下述多核苷酸，所述多核苷酸包含侧翼为序列A和序列B的经优化的内切核酸酶的DNA识别位点，

c.提供包含序列A’和B’的多核苷酸，所述序列A’和B’足够长并且与序列A和序列B足够同源，从而允许在所述细胞中同源重组，以及

d.提供如权利要求1至9中任意一项所述的优化的内切核酸酶或如权利要求12所述的表达盒，

e.在所述细胞中组合b)、c)和d)，以及

f.检测b)和c)的重组多核苷酸，或选择出或生长包含b)和c)的重组多核苷酸的细胞。

16.如权利要求15所述的用于多核苷酸同源重组的方法，其中，同源重组之后，步骤a)的所述感受态细胞中包含的多核苷酸序列从步骤f)的生长细胞的基因组中缺失。