[发明专利]带有氯化氨基酸的胰岛素类似物

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年12月11日提交的待审美国临时申请号61/285,955的权益。

关于联邦政府资助研究或开发的声明

本发明在由国立卫生研究院授予的合作协议下由政府支持完成，补助号为DK40949和DK074176。美国政府可享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及抵抗热降解的多肽。更具体地，本发明涉及热稳定的胰岛素类似物。甚至更具体地，本发明涉及通过在其氨基酸中掺入氯元素而化学和热稳定的胰岛素类似物。氯被分类为卤素，因其原子半径、电负性、局部电荷的立体电子分布和对分子中邻近原子的立体电子特性的传送效应而区别于蛋白质中的一般组成。

发明背景

超稳定蛋白质(包括治疗剂和疫苗)工程在无法连续获得电和冷藏的发展中世界的地区可能具有广泛的社会效益。胰岛素提供了易于热降解的治疗性蛋白质的实例。非洲和亚洲糖尿病的即将来临的流行加深了因胰岛素的化学和物理降解而致的挑战。因为胰岛素类似物的化学降解速率与其相对稳定性反相关，所以超稳定制剂的设计可提高所述挑战区域内胰岛素代替疗法的安全性和功效。

小有机分子中一些卤素取代的效用在药物化学中已知。氟化官能团对治疗中广泛采用的小分子的功效至关重要，所述小分子为例如胆固醇生物合成抑制剂阿托伐他汀(Liptor?)以及用于治疗抑郁和其它情感障碍的选择性血清素再吸收抑制剂盐酸氟西汀(Prozac?)。虽然氟原子半径与氢原子半径相似，但其巨大的诱导效应改变了这些药物的立体电子特性，进而增强药物的生物学活性。物理有机化学的类似考虑涉及更大的卤素原子例如氯的掺入。小分子孟鲁司特钠(montelukast sodium) (Singulair?)是白细胞三烯抑制剂，通过共价掺入氯原子来增强其药学特性。另外，2009年7月31日提交的国际专利申请号PCT/US2009/52477提供了胰岛素类似物中氟取代氨基酸的用途。

与掺入氟原子的上述效应相比，在科学文献中较少良好表征通过位点特异性掺入氯原子到修饰的氨基酸中来调整蛋白质的化学、物理和生物特性。

芳族侧链可参与许多种弱极性相互作用，其不但涉及邻近芳环，而且还涉及正或负静电势的其它来源。实例包括肽键中的主链羰基和酰胺基。

胰岛素给药早已建立为糖尿病的治疗。胰岛素是小的球状蛋白质，在脊椎动物的新陈代谢中起着重要作用。胰岛素含有两条链，其中A链含有21个残基，B链含有30个残基。该激素以Zn²⁺稳定的六聚体储存于胰β-细胞中，但在血流中以无Zn²⁺的单体发挥作用。胰岛素是单链前体胰岛素原的产物，在胰岛素原中连接区(35个残基)将B链的C-末端残基(残基B30)连接到A链的N-末端残基上(图1A)。虽然尚未测定胰岛素原的结构，但许多证据表明其由胰岛素样的核心和无序的连接肽组成(图1B)。认为在糙面内质网(ER)中三个特异性二硫键(A6-A11、A7-B7和A20-B19，图1A和1B)的形成与胰岛素原的氧化折叠偶联。从ER中输出到高尔基体后，胰岛素原即刻装配形成Zn²⁺配位的可溶性六聚体。内切蛋白酶解消化及转化为胰岛素发生在未成熟的分泌颗粒中，接着发生形态学凝聚。已通过电镜学(EM)观察到成熟贮藏粒中锌胰岛素六聚体的晶体阵列。

已对Zn²⁺配位的胰岛素六聚体，即生理学上的储存形式，进行了大量X-射线晶体学研究。在体外已阐述了多种晶形，定义了三个结构家族，命名为T₆、T₃R^f₃和R₆。在这些六聚体中，认为两个Zn离子位于沿六聚体中心轴的位置，每一个Zn离子被三个组氨酸(HisB10)配位；在一些晶形中观察到另外的低亲和力的Zn结合位点。T态原体类似于溶液中胰岛素单体的结构。R态原体在B链的二级结构上表现出变化：中央α-螺旋延伸至B1 (R态)或至B3 (扰乱的R^f态)。