[发明专利]用于过继细胞疗法的细胞培养的改进方法

说明书

技术领域

本发明总体上涉及培养细胞的方法，更具体地涉及用于细胞疗法的细胞的培养。

背景技术

细胞培养是导致细胞疗法的成本和复杂性的主要因素。就目前的方法而言，培养细胞的工艺既耗时成本又高。通常，为了制备出大量的细胞而采用在各阶段中进行的体外培养工艺。在最初的阶段，目标细胞是被置于细胞培养装置内的细胞组合物中的相对较小的群体。在此阶段，细胞组合物通常包括：目标细胞的来源(例如外周血单核细胞)、刺激目标细胞的生长和/或提呈抗原的饲养细胞。让其中驻留细胞的培养基通常处于不受干扰状态的培养装置及方法是有利的，因为这些细胞保持为相对未受干扰的状态。这种装置包括：标准组织培养板、培养瓶、和培养袋。在各阶段中进行的培养通常是由以下步骤组成：让细胞组合物消耗培养基中的生长基质(如葡萄糖)、去除用过的培养基、用新鲜培养基更换用过的培养基、以及重复该步骤直到获得期望数量的目标细胞。常常是，当目标细胞群增加且需要额外的生长表面时，将细胞组合物转移到其它装置中以开始制备的新阶段。然而，就常规方法而言，当生长表面上的细胞群增加时，目标细胞的群生长速率减慢。最终结果是制备相当数量的目标细胞群既很耗时又复杂。

用于产生具有针对Epstein Barr病毒的抗原特异性的T淋巴细胞(EBV-CTL)的制备方法的现有技术状态提供了制备复杂性的一个例子。在使EBV-CTL实现最佳扩增的常规方法中使用标准24孔组织培养板，各孔具有2cm²的供细胞驻留的表面积，由于气体传输要求而将培养基体积限制在1ml/cm²。通过在经辐照抗原呈递细胞系(可以是淋巴母细胞系(LCL))存在下放置入由PBMC(外周血单核细胞)组成的细胞组合物，以开始培养工艺，约1×10⁶PBMC/cm²与2.5×10⁴经辐照抗原呈递细胞/cm²表面密度(即细胞/cm²生长表面)比为约40∶1。这促使细胞组合物中的EBV-CTL群在数量上扩增。9天后，在经辐照抗原提呈LCL存在下、以4∶1的新表面密度比、在大约2.5×10⁵EBV-CTL/cm²的最小表面密度下，EBV-CTL再次选择性地扩增。将培养基体积限制在生长表面积的最大比为1ml/cm²以使氧气能够到达细胞，这对生长溶质(例如葡萄糖)产生了限制。结果，可以达到的最大表面密度约为2×10⁶EBV-CTL/cm²。因此，最大每周细胞扩增率约为8倍(即2×10⁶EBV-CTL/cm²除以2.5×10⁵EBV-CTL/cm²)以下。EBV-CTL的继续扩增要求每周将EBV-CTL转移到另外的24孔板中且进行抗原再刺激，并且每周更换两次24孔板中各孔内的培养基和生长因子。因为在常规方法中当EBV-CTL表面密度达到各孔的可能最大量时导致EBV-CTL群的扩增速率减慢，所以必须在较长的制备期(经常长达4-8周)内重复这些操作，以获得充分数量的EBV-CTL以用于细胞输注和质控检测(例如无菌、鉴别和效能测定)。

EBV-CTL的培养只是细胞疗法所特有的复杂细胞制备工艺的一个例子。因此，需要一种可以缩短制备时间同时降低制备成本和复杂性的、培养用于细胞疗法的细胞的更实用方法。

我们已创建了提高整个制备中的细胞群生长速率的新方法，由此减小制备细胞的复杂性和所需时间。

发明内容

已发现，与目前可能方法相比，通过采用允许在整个制备工艺中定期地再建立非常规条件的分阶段制备工艺，可以在更短的时间段内以更经济的方式进行用于细胞疗法的细胞制备。所述非常规条件包括：减小的目标细胞的表面密度(即细胞/cm²)、目标细胞与抗原提呈细胞和/或饲养细胞的新比率、和/或使用具有增加的培养基体积/表面积比且由透气性材料构成的生长表面。

本发明的具体实施方式涉及用于细胞疗法用途的细胞的改进培养方法。这些方法包括如下方法：通过采用使目标细胞群能够相对于常规方法在整个制备工艺中维持更高生长速率的各种新方法，来降低制备期望数量的目标细胞的所需时间、成本和复杂性。