[发明专利]用于控制欧洲玉米螟的包含CRY1Ab和CYR2Aa的杀虫蛋白组合，和管理昆虫抗性的方法

说明书

发明背景

人类种植玉米以用于食物和能量的供应。昆虫吃并损害植物从而破坏这些人类的努力。

目前已经通过植物表达编码来自苏云金芽孢杆菌的Cry1Fa蛋白的晶体(Cry)内毒素基因而实现了这些害虫的植物内转基因控制。Cry1Fa是目前Dow AgroSciences的Herculex^TM品牌下的转基因玉米种子(Herculex，Herculex-Extra，和Herculex-RW)中的毒素蛋白，其对FAW和ECB昆虫害虫有抗性。该蛋白通过结合至位于昆虫中肠内的特定受体并在肠细胞上形成孔而起作用。这些孔的形成阻止昆虫调节渗透压平衡并导致其死亡。

然而，存在一些情况，即昆虫可能能够通过其肠道中结合Cry1Fa的受体的遗传改变而发展对Cry1Fa活性的抗性。产生具有降低的结合Cry1Fa能力的受体的昆虫会对Cry1Fa的活性有抗性，从而在表达该蛋白的植物中存活。

当植物在生长状态期间持续表达单一的Cry毒素时，有这种情况，即昆虫可以通过昆虫肠道内的结合Cry1Fa毒素的受体的遗传改变而发展对该蛋白的活性的抗性。由受体的这些改变而引起的毒素结合的降低会导致Cry1Fa毒性的降低，并可能导致最终作物中表达的蛋白的效力降低。

发明概述

本发明部分地涉及叠加Cry1Ab蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特别是玉米)(corn or maize)更持久并更少的倾向于允许昆虫发展对这两种毒素的任意一种的活性的抗性。这些叠加可以特别用于靶标欧洲玉米螟(ECB)。

发明详述

本发明部分地涉及叠加Cry1Ab蛋白和Cry2Aa蛋白以使得植物(特别是玉米)更持久并更少的倾向于允许昆虫发展对这两种毒素的任意一种的活性的抗性。这些叠加可以特别用于靶标欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)。

本发明也部分涉及三倍叠加或三种(或更多)蛋白毒素的“金字塔”，由Cry1Ab和Cry2Aa毒素作为基础对。(“分离的活性位点”，意思是给定的蛋白的任何一个不引起相互之间的交叉抗性。)增加靶向ECB的第三种蛋白能提供具有针对ECB的行为的第三个位点的蛋白。在一些优选的实施方式里，第三个蛋白可以选自DIG-3(参见US 2010-00269223)，Cry1I，Cry1Be，Cry2Aa，和Cry1Fa。参见例如USSN 61/284,278，提交于2009年12月16日。也参见US2008-0311096。

从而，在一些优选的金字塔实施方式里，选择的毒素具有针对ECB的作用的分离的位点。此外，优选的金字塔组合为本发明的蛋白对加第三个IRM蛋白。

本发明的对或三倍叠加(对ECB活性)也可以与另外的蛋白组合——例如靶向秋粘虫(FAW)。这样的蛋白包括例如Vip3，Cry1C，Cry1D，和/或Cry1E。Cry1Be和/或Cry1Fa也可以用于靶向FAW和ECB。

GENBANK可以用于获得本文公开或提及的任何基因和蛋白的序列。参见附录A。

本发明也涉及三种杀虫蛋白(在一些优选实施方式里是Cry蛋白)，其对单一的靶标害虫有活性，但是不导致相互之间的交叉抗性。

生产这三种(至少)毒素的植物(和种植该植物的面积)也包含在本发明的范围之内。也可以加入其它的毒素/基因，但是这些特别的三倍叠加根据本发明可以便利地和令人惊讶地提供针对ECB的活性的三个位点。

本发明的对或三倍叠加(和/或其它蛋白的组合)能有助于减少或消除对避难所面积的需求(即，少于40%，少于20%，少于10%，少于5%，或甚至0%的避难所)。从而种植了超过10英亩的田地也包含在本发明之内。提供的多核苷酸优选在遗传构建体中并在非苏云金芽孢杆菌启动子的控制之下。提供的多核苷酸可以包含用于在植物中增强表达的密码子。

为了阻碍昆虫发展针对Cry蛋白的抗性的能力，我们鉴别了不竞争性结合至ECB肠受体蛋白的Cry毒素。发现Cry1Ab不取代结合至位于ECB幼虫的昆虫肠道中的受体的Cry2Aa。

我们发现Cry2Aa和Cry1Ab对ECB幼虫是毒性的，然而它们不完全与同样的受体位点结合；这显示它们的毒性不会在ECB中提供交叉抗性。