[发明专利]用晶体IBE和晶体IF（CRY1BE和CRY1F）蛋白的组合进行的昆虫抗性管理

说明书

发明背景 

人类种植玉米以用于食物和能量的供应。昆虫吃并损害植物从而破坏这些人类的努力。 

目前已经通过植物表达编码来自苏云金芽孢杆菌的Cry1Fa蛋白的晶体（Cry）δ内毒素基因而实现了这些害虫的植物内转基因控制。Cry1Fa是目前Dow AgroSciences的Herculex^TM品牌下的转基因玉米种子(Herculex，Herculex-Extra，和Herculex-RW)中的毒素蛋白，其对秋粘虫(FAW，Spodoptera frugiperda)和欧洲玉米螟(ECB，Ostrinia nubilalis)昆虫害虫有抗性。该蛋白通过结合至位于昆虫中肠内的特定受体并在肠细胞上形成孔而起作用。这些孔的形成阻止昆虫调节渗透压平衡并导致其死亡。 

然而，存在一些情况，即昆虫可能能够通过其肠道中结合Cry1Fa的受体的遗传改变而发展对Cry1Fa活性的抗性。产生具有降低的结合Cry1Fa能力的受体的昆虫会对Cry1Fa的活性有抗性，从而在表达该蛋白的植物中存活。 

当植物在生长状态期间持续表达单一的Cry毒素时，有这种情况，即昆虫可以通过昆虫肠道内的结合Cry1Fa毒素的受体的遗传改变而发展对该蛋白的活性的抗性。由受体的这些改变而引起的毒素结合的降低会导致Cry1Fa毒性的降低，并可能导致最终作物中表达的蛋白的效力降低。参见例如US20090313717，其涉及Cry2蛋白加Vip3Aa，Cry1F或Cry1A以控制玉米夜蛾(Helicoverpa zea)或棉铃虫(armigera)。WO 2009132850涉及Cry1F或Cry1A和Vip3Aa以控制草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。US 20080311096涉及Cry1Ab以控制Cry1F-抗性的ECB。 

其它Cry毒素列在官方B.t.命名委员会的网站上(Crickmore et al.；lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)。参见所附的附录A。目前有近60种主要的组的“Cry”毒素(Cry1-Cry59)，和其它Cyt毒素和VIP毒素等等。各个数字组的很多具有大写字母的亚组，而大写字母亚组具有小写字母的亚-亚组。(例如，Cry1具有A-L，而Cry1A具有a-i)。 

参考文献van Frankenhuyzen(2009)(J.Invert.Pathol.101:1-16)，例如，阐 述了由很多靶标害虫和大量毒素，可以潜在的选择来控制靶标害虫。参见例如van Frankenhuyzen的图3。可以作为靶标的(很多种之中的)一种害虫可以包含欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，对于该昆虫，van Frankenhuyzen的图3显示了对ECB活性的17种毒素，和一种可能有活性。没有这些选项的完全列表。 

van Frankenhuyzen的图3也阐明了每种Cry蛋白具有独特的活性谱——其对一些昆虫有活性而不是其它的。Cry蛋白典型地结合昆虫肠中细胞的的受体，并且这是影响活性谱的一个因素。一种Cry蛋白的受体可以在一些昆虫中找到而不是其它的；一种给定的昆虫可能具有一或多种Cry蛋白而不是其它Cry蛋白的受体。 

已知有很多可能的靶标昆虫，并且有针对任意给定昆虫的活性的很多可能的Cry蛋白，单独的数字证明了抗性控制问题的复杂性。考虑到van Frankenhuyzen鉴别出仅18种蛋白对ECB有或可能有活性，这将使得数百种可能的毒素对以测试其组合。 

另外，竞争性/非竞争性结合分析不是一个容易的任务。这会涉及放射性标记和放射性标记的蛋白的取代的分析。这本身是一种复杂的技术。 

尝试直接使用抗性昆虫也是很复杂的。昆虫的抗性株必须经发展针对给定蛋白的抗性。Siqueira(June 2004；J.Econ.Entomol.，97(3):1049-1057)陈述了(在摘要中)“不同毒素之间的交叉抗性的测试受限于缺乏抗性克隆”。这表明了获得用于分析蛋白的抗性管理潜力的抗性昆虫株的困难性。当涉及蛋白对时，可以使用任一蛋白以尝试筛选抗性昆虫的发展。