[发明专利]用于诊断不同亚型肺癌的基于组织的微-RNA方法

说明书

发明领域

本发明涉及已经过证实的miRNA生物标记和相应的方法，以用于可靠地在外科手术和活组织检查肺组织中组织中不同亚型的肺癌，特别是用于区别不同亚型的肺癌。所述肺癌亚型包括腺癌肺癌、鳞状细胞肺癌和小细胞肺癌。

发明背景

肺癌依然是世界上男性和女性癌相关死亡中最常见的原因。据估计在2009年有约1400000新增病例，伴随平均2.51%的年增长率(Frost&Sullivan估计)，这些在2009年诊断为肺癌15的患者绝大多数将会死于该疾病(Higgins,M.J.et al.(2009)Expert Rev Anticancer Ther 9,1365-1378)。尽管在过去的几十年中外科技术和联合治疗有了一定的改进，但在美国和欧洲不同分期肺癌患者的总5年存活率仅约15%。

肺癌分类为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)或非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。主要的(80%)肺癌组织学类型为NSCLC包括腺癌和鳞状细胞状细胞癌。吸烟是发生肺癌的最重要风险因子，占世界范围内男性肺癌病例中的80%和女性肺癌患者中的50%。

肺癌治疗依不同的癌亚型而异。对早期NSCLC的治疗选择是外科手术，有40%的总5年存活率。但是，多数患者在诊断时已处于晚期，使得一线治疗仅局限于多药联合化疗而且预期存活率少于8个月。在靶向治疗方面的近期进展要求对非小细胞肺癌(NSCLC)30更准确地亚型分类。癌血管生成抑制剂可使鳞状细胞状细胞癌患者更易于发生异常反应(Lebanoy,D.(2009)J Clin Oncol 27,2030-2037)。小细胞肺癌(SCLC)患者是肺癌中致死性最高的亚型，患者死亡率高于90%。尽管在早中期患者中常观察到高初始反应率，中位存活率也有约20个月。但外科手术对SCLC的治疗几乎是无效的，化疗或化疗放疗联合才是治疗选择。

除了对不同亚型和不同病因肺癌的不同治疗，监测者间的差异和缺乏特异、标准化的检测也限制了当下对患者实施充分策略化合适治疗的能力。对肺癌患者个体的治疗决策很快将基于详细的癌和宿主特征。用于区分肺癌亚型的特异性分子生物标记是绝对需要的。

许多诊断性检测也受限于一般是基于对单一分子指标的分析，而这种分析可能影响检测的可信度和/或准确性。此外，单一指标通常并不能对潜伏阶段、癌进展等进行详细预测的。因此，仍然需要发掘可供选择的分子指标和检测方式来克服这些局限。

解决这一问题的方法之一可以基于调控性RNA分子，特别是基于由20-25个核酸大小的进化保守的内源性表达的非编码RNA，该类RNA可介导靶mRNA表达并以此自从其在10年前发现以来被证实参与细胞发育、分化、增殖和凋亡的微RNA(miRNA)(Bartel,D.P.(2004)Cell 116,281-297,Ambros,V.(2004)Nature 431,350-355;He,L.et al.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。而且，由于其在体外非常稳定和在体内的长期存在，miRNA有作为癌生物标记的其他mRNA所没有的优势(Lu,J.et al.,(2005)Nature 435,834-838;Lim,L.P.et al.,(2005)Nature 433,769-773)。

miRNA产生于原发转录并被RNase III Drosha加工成茎-环状结构的前体(pre-miRNA)。转运到细胞质后，另一名为Dicer的RNase III剪切pre-miRNA发夹的环形成短双链RNA，其中一条链以成熟miRNA整合成miRNA-蛋白质复合体(miRNP)。其中的miRNA引导miRNP到靶mRNA发挥功能(Bartel,D.P.(2004)Cell 23,281-292;He,L.and Hannon,G.J.(2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。

根据miRNA与其目标间的互补程度，miRNA可引导不同的调控过程。与miRNA高互补的mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制被特异性剪切。因此，在这种情况下，miRNA作为短干扰RNA(siRNA)发挥功能。靶向与miRNA互补性较弱的mRNA要么被导向细胞降解途径或在不影响mRNA水平的状态下被翻译抑制。但，miRNA如何抑制靶mRNA的翻译机制仍有争议。