[发明专利]增强自然杀伤细胞增殖和活性的方法

说明书

技术领域

本发明，在其某些实施方式中，涉及自然杀伤（NK）细胞的离体（体外，ex-vivo）培养，更具体地，而不排他地，涉及通过用烟酰胺处理所述细胞并结合细胞因子促进的NK细胞增殖而增强NK细胞繁殖和/或功能性的组合物和方法。

背景技术

自然杀伤（以下也简称为“NK”）细胞是参与免疫反应的淋巴样细胞。这些细胞具有多种功能，特别是杀伤肿瘤细胞、发生致癌转化的细胞和活体内其它不正常的细胞，是先天免疫监督机制的重要组成部分。采用用NK细胞的免疫治疗的临床经验，强调了强效并有效地扩增NK细胞群并同时保持甚至增强其体内功能性（杀伤能力、转运、定位、持续和增殖）的更好方法的需要。

NK细胞根据表型和功能代表了不同的淋巴细胞群。NK细胞具有大颗粒淋巴细胞形态并表达特征NK细胞表面受体，同时缺乏TCR重排和T细胞、B细胞、单核细胞和/或巨噬细胞表面标志。细胞杀死通过释放蛋白质的小胞质颗粒（穿孔素和颗粒酶）而导致靶细胞通过细胞凋亡而死亡。NK细胞具有通过启动MHC I类分子、MHC类I类分子和与MHC无关的分子的多个抑制和活化受体而区分潜在的“靶”细胞和健康细胞的机制（Caliguiri Blood 2008 112:461-69）。抑制性NK细胞受体包括HLA-E（CD94/NKG2A）；HLA-C（组1或2），KIR2DL；KIR3DL（HLA-B Bw4）和HLA-A3或A4+肽。激活性NK细胞受体包括HLA-E（CD94/NKG2C）；KIR2DS（HLA-C）和KIR3DS（HLA-Bw4）。其它受体包括NK细胞受体蛋白-1（在小鼠中称为NK1.1）和对IgG的Fc部分低亲和力受体（FcγRIII；CD16）。Cosman等人的美国专利申请US20090234699详细描述了具体的NK细胞活化器、UL结合蛋白（ULBP）和其潜在的治疗用途。（其结合于本文中作为参考）。“激活性”和“抑制性”的表面受体控制NK细胞的细胞毒活性。对于治疗考虑因素重要的是，需要NK细胞抑制作用以防止通过“激活”NK细胞破坏正常的宿主组织，但在NK细胞中抑制性信号传递看起来比活化信号更强。

完整骨髓对于NK细胞生成是必要的。人类骨髓来源的NK细胞是CD2+CD16+CD56+表型的大颗粒淋巴细胞（LGL），缺乏CD3，还包含T-细胞受体ζ链[Zeta（ζ）-TCR]。NK细胞可以在各种淋巴样和非淋巴样组织中，包括血液、脾、肝、肺、肠和蜕膜中找到。在肿瘤中已发现相当数量的NK细胞，其中这些细胞可能发挥抗肿瘤活性。

NK细胞展示出抗病毒感染和肿瘤细胞的自发非MHC-限制的细胞毒活性和体内病毒性感染和癌进展的介导抗性。因此，NK细胞代表先天免疫的关键效应器细胞。此外，NK细胞具有多种其它功能，包括分泌细胞因子的能力和调节适应性免疫应答和造血功能。NK细胞在几个实验动物模型中的感染早期期间内提供了必要的γ-干扰素（IFN-γ）。

大多数癌在HLA的背景下缺乏可识别的肿瘤特异性抗原，因此不可能屈服于抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞。由于广泛的癌细胞对NK细胞活性敏感，则能够采取移植自然杀伤（NK）细胞在异源位置对抗癌细胞，而无移植物抗宿主病的风险。

最近研究都强调这种潜在的NK细胞疗法。在移植的动物模型中，供体NK细胞溶解白血病细胞和宿主淋巴造血细胞，而不会影响非造血组织。因为NK细胞受结合至杀伤性免疫球蛋白样受体（KIR）的自我HLA分子抑制，这些发现已经导致了选择采用有助于NK-细胞活化（HLA-和KIR错配）的HLA和KIR型造血干细胞移植受体的临床实践，由此可能预期促进抗白血病作用。然而，“最好”供体的选择受限于具有不只一个潜在的供体的患者，NK细胞溶解淋巴样细胞的能力一般较低而难以预测。自身免疫性疾病中NK细胞分布和功能的一项调查已经表明在许多自身免疫性疾病（如SLE，干燥综合征，多发性硬化，牛皮癣，RA，溃疡性结肠炎等）中NK细胞群的数量和功能降低。因此，用NK细胞的治疗能够主动抑制潜在致病性自身免疫性T细胞，自身免疫性T细胞可以介导骨髓移植后炎性反应，调节抗原非特异性模式中自身免疫记忆T细胞激活而维持临床缓解和防止GVH效应。

对于临床使用，NK细胞通常通过白细胞分离而从患者或捐献者收集。然而，最大的NK细胞剂量是有限的，而高NK细胞剂量只可能为低体重患者获得，致使孩子们成为NK细胞疗法的最佳人选。值得注意的是，NK细胞的总数和活性在病毒性感染和/或癌中显著降低，而使得基于内源性NK细胞激活的免疫疗法无效。此外，难治性的复发是细胞输入中主要的并发症，而许多临床方案需要反复输注淋巴细胞群。