[发明专利]用于在RNA噬菌体的病毒样颗粒上进行肽展示和亲和选择的质粒和方法

说明书

相关申请和基金支持

本申请要求:2009年12月31日提交的名为Control of Peptide Display Valency on VLPs的美国临时申请61/335,122；2009年12月31日提交的名为Plasmid Vectors for Facile Construction of Random Sequence Peptide Libraries on Bacteriophage MS2VLPs and Related Constructs,Libraries,and Methods的美国临时申请61/335,120；以及2009年12月31日提交的名为“Peptide Display on Virus-Like Particles of Bacteriophage PP7”的美国临时申请61/335,121的优先权，每个申请的内容均通过引用全部并入本文。

本专利申请得到了National Institutes of Health的基金GM042901和RO1AI065240的支持。美国政府对本申请拥有某些权利。

发明领域

本发明涉及在RNA噬菌体，特别是MS2和PP7的病毒样颗粒(VLPs)上进行肽展示的系统和方法。描述的方法和质粒载体用于协助构建高复杂度的随机序列和抗原片段文库，从而由其经亲和选择分离具有所需结合功能的肽。由于肽展示的密度是亲和选择严紧度的一个重要决定因素，还描述了用于控制VLPs上肽展示效价的方法和质粒。本发明的方法使得可以在大范围内灵活地调节VLPs，特别是MS2VLPs上的展示效价水平(即从每个颗粒上平均低于1到多达90)，从而促进免疫原和疫苗的鉴定和生产，包括展现低效价的VLPs。尽管该系统主要是为了疫苗开发而建立的，它在许多其他应用中也有用途，包括鉴定可用于细胞型或组织型特异性靶向递送药物和造影剂的肽-VLPs，和新材料的模板法合成。

本申请描述了协助实施VLP展示系统的方法和质粒载体。发明提供了可用于病毒样颗粒的表达的核酸构建体，所述病毒样颗粒包含MS2或PP7的外壳多肽，各自经插入异源肽进行了改造，其中所述异源肽被展示在病毒样颗粒上，并包裹着特定的RNA(MS2或者PP7的RNA)，后者引导VLP以及其上展示的肽的合成。还提供了相关的病毒样颗粒、方法和免疫原性组合物。

发明背景

VLPs作为疫苗。近年来重组DNA技术的发展引领了疫苗的产生，其中免疫原性蛋白经过鉴定、克隆并在合适的宿主中表达以获得足够量的蛋白，从而在动物和人中达到有效的保护性免疫。最有效的疫苗中有许多是基于毒粒表面强有力引发中和抗体的能力。这包括已被许可的能够有效诱发保护性抗体反应的灭活或减毒病毒疫苗，比如脊髓灰质炎、流感和狂犬病疫苗。最近，Food and Drug Administration批准的亚基疫苗是基于人乳头瘤病毒(HPV)和乙肝病毒(HBV)的结构蛋白的自我组装。所述亚基在合适的宿主中得以表达，然后自组装成某种颗粒，其在结构上类似真正的病毒，但因缺少病毒基因组而没有感染性。这些所谓的病毒样颗粒(VLPs)大体来说是高度免疫原性的，因为组成它们的结构蛋白在每个单独的颗粒中有多个拷贝。这种高密度抗原呈递使得这些颗粒能够特别有效地激发强抗体反应。HBV和HPV疫苗是基于由相应病毒自身的结构蛋白组装而成的VLPs，但VLPs也可以作为支架用于异源表位的高密度展示。由于VLPs一般代表了高度重复，因此也是高度免疫原性的结构，它们可以来源于任何数量的不同病毒类型。发明所述方法致力于利用RNA噬菌体(尤其是MS2和PP7)VLPs，通过与噬菌体展示[1，2]类似的方法进行免疫原展示和表位搜寻。

RNA噬菌体。单链RNA噬菌体是一组在自然界中广泛分布的病毒。有多种RNA噬菌体在基因组序列、分子生物学和衣壳结构与组装方面已被深入研究过。MS2可能是这组病毒中被最好地研究过的成员，也是发明人实验室中进行过的多数工作的重点，虽然我们的近期工作也探索了称为PP7的相关噬菌体。MS2含有3569个核苷酸组成的单链RNA基因组，其仅编码四种蛋白:成熟酶、外壳、裂解和复制酶。病毒颗粒由180个外壳多肽、一个成熟酶分子和一个拷贝的RNA基因组构成。因为外壳蛋白自己完全负责二十面体壳的形成，可以由质粒以单个基因的产物生成MS2VLP。因此，与用于肽展示的其他噬菌体相比，RNA VLPs出奇地简单。发明人近期报道[1,2]了对MS2和PP7VLPs进行改造用于肽展示和亲和选择，本文件后面也将有描述。