[发明专利]重组病毒载体的结构及其制备

说明书

技术领域：

本发明主要涉及病毒学和分子生物学，尤其是重组病毒载体生产的构成配方及方法。

背景技术：

搭载有外源基因的重组病毒载体可用于将外源基因导入到细胞内。在细胞内，外源基因可进行表达从而产生多聚肽或多聚核酸（例如miRNA、RNAi、反义RNA）进而治疗或改善人或其他哺乳动物的遗传缺陷疾病。外源基因的插入同时可用于DNA重组和基因的修复，在这种情况下，外源基因的沉默是必要条件。

用于外源基因转运的重组病毒载体通常缺少病毒复制所需的一个或数个基因，这样，在接受治疗的病人体内，重组病毒载体并不能进行自我复制增殖。在重组病毒的生产构建过程中，这些所缺失的基因通过互补的方式从非重组病毒的外源性DNA序列获得补充，从而使重组病毒能够进行复制和包装。但是，由于这些外源性DNA序列和重组病毒基因组同时存在于宿主细胞的细胞核内，这些DNA序列和重组病毒基因之间的能够发生重组反应，可能导致产生在临床治疗过程中所不愿见到的具有完整复制活性的病毒。

因此，一个既生产不被具有复制活性的完整病毒污染，同时又易于工业化生产的重组病毒载体制备方法就显得十分必要。

发明概述：

本发明主要涉及一种在生产复制缺陷型重组病毒载体过程中清除或减少具有完整复制活性病毒的新方法。复制缺陷型重组病毒载体通常含有一个或数个病毒基因缺失。该方法步骤包括：使用含有编码一个或数个复制缺陷型病毒载体反式因子或其变体的携带病毒感染宿主细胞、培养感染的宿主细胞至所需时间以及分离复制缺陷型重组病毒载体。该携带病毒为任何一种细胞质病毒。因为是细胞质病毒， 所以携带病毒能使其基因组保存在宿主细胞的细胞质中。携带病毒上所编码的一个或多个重组病毒反式因子能补偿重组病毒复制和包装所缺失的一个或多个基因的功能。携带病毒上所编码的一个或多个重组病毒反式因子也包含复制缺陷型重组病毒的结构蛋白。整个重组病毒的DNA则在宿主细胞里面并保留在宿主细胞的细胞核内。

本发明同时介绍一种生产具有一个或多个基因缺陷的复制缺陷型重组病毒载体的方法。该方法步骤包括：使用含有编码一个或数个复制缺陷型重组病毒的反式因子或其变体的携带病毒感染宿主细胞、培养感染的宿主细胞至所需时间以及分离复制缺陷型重组病毒载体。携带病毒为任何细胞质病毒。携带病毒能把病毒载体的反式因子基因组保留在宿主细胞的细胞质中。其病毒载体的基因组能补偿重组病毒复制和包装所缺失的一个或多个基因的功能，其反式因子包含有复制缺陷型重组病毒中的结构蛋白。宿主细胞则含有整个重组病毒基因组并将其保留在宿主细胞的细胞核内。复制缺陷型重组病毒载体包括选自腺病毒科、疱疹病毒科、嗜肝DNA病毒科的重组病毒载体以及重组微小病毒载体中的任何一种。

本发明同时介绍一种复制缺陷型重组AAV载体的生产制备方法。重组AAV病毒载体缺失衣壳蛋白的基因组。该方法步骤包括：使用含有编码一个或数个AAV反式因子或其变体的携带病毒感染宿主细胞、培养感染的宿主细胞至所需时间以及分离复制缺陷型重组AAV载体。携带病毒为任何细胞质病毒，携带病毒有二个至多个AAV衣壳蛋白基因编码，能在宿主的细胞质中合适比例表达这些蛋白，一促进复制缺陷型AAV载体复制和包装。宿主细胞则含有重组AAV基因组并将其保留在宿主细胞的细胞核内。

本发明同时介绍携带病毒。携带病毒由衣壳蛋白和携带病毒基因组组成。携带病毒基因组由细胞质病毒的DNA序列以及编码二个至多个AAV结构蛋白或其变体的DNA序列组成。衣壳蛋白和来自细胞质病毒的DNA序列使其进入宿主细胞后能在细胞质中稳定存在。携带病毒病毒基因组能以合适的比例表达二个至多个AAV结构蛋白，进而以促进缺少二个至多个AAV结构蛋白的重组AAV载体生产。

附图说明：

图1-为现有（以前）生产重组病毒载体示意图。RCV是“有自复制能力病毒”

图2-为通过分隔反式元件和顺式元件到不同的细胞部位， 得以生产无“具有复制活性病毒“（RCV）的重组病毒载体的方法示意图。

图3-为使用痘苗病毒作为反式元件携带病毒以生产重组AAV载体的的示意图。

图4-为使用痘苗病毒作为反式元件携带病毒以生产重组腺病毒载体的的示意图。

图5-为使用痘苗病毒作为反式元件携带病毒以生产高容量腺病毒载体的的示意图。

图6-为使用VSV病毒作为反式元件携带病毒以生产重组AAV载体的的示意图。