[发明专利]用于检测恙虫病东方体的引物对和使用所述引物对的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于诊断恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）的引物对和使用所述引物对的诊断恙虫病东方体的方法，更具体而言，本发明涉及能够对恙虫病东方体（引发恙虫病（scrub typhus）的原因）的16s核糖体RNA基因的碱基序列进行扩增的引物对和使用所述引物对通过对恙虫病东方体进行检测的恙虫病检测方法。

背景技术

恙虫病为一种急性热病（febrile disease），该病通过感染了恙虫病东方体的恙螨进行传播，并由于系统性血管炎而显示出特征性的临床症状。啮齿动物为主要宿主，幼螨（恙螨）为宿主和媒介。

自恙虫病1951年首次在韩国报道以来，这种主要的秋季热病已蔓延至全国各地，特别是在九月至十一月期间。尤其是，已发生了如此之多的病例，以至于秋季中30%的患者都被诊断为恙虫病。

恙螨叮咬后的1-2周内将产生如下症状：例如发热、发冷、头疼、肌肉疼痛和红斑性丘疹。对产生的特征焦痂的检测将有助于该疾病的早期诊断。通常，这一疾病的发展并不严重，并且抗生素对该疾病很有效。然而，如果发生延误诊断，则可产生如下形式的并发症：肺炎、急性肾衰竭、脑膜炎、脑炎、上胃肠道出血、多器官功能障碍、或者甚至更糟的心肌梗死或中风。这些并发症可能是致命的，因此快速而准确的诊断是改善患者预后所必不可少的。

到目前为止，用于诊断恙虫病的方法包括如下方法：例如，通过培养以确认恙虫病东方体的方法、通过对患者血清中的抗恙虫病东方体的抗体进行检测的方法、以及通过PCR（聚合酶链式反应）扩增对从患者血液中分离的恙虫病东方体的DNA进行检查的方法。

在这些方法中，通过对恙虫病东方体进行培养的诊断方法需要至少几周来培养恙虫病东方体，这表明这一方法实际上不适合用于诊断患者的目的。所以，最常见的诊断方法为间接荧光抗体技术和免疫酶技术，其均为血清学检测方法。

然而，上述方法仍具有如下缺点：由与其它病原微生物的交叉反应所造成的假阳性；从疾病症状开始后直至形成抗体需要几天，导致该疾病早期测试的低灵敏度；以及需要额外的跟踪测试来对诊断进行确认。

介绍了恙虫病的另一诊断方法，该方法是通过PCR对来自患者血液的恙虫病东方体特异性DNA进行检测、以在恙虫病的早期阶段对其进行快速诊断的方法。PCR的实例包括：常规PCR；或巢式PCR，巢式PCR通过对常规PCR进行改进而得到，并显示出高于常规PCR100倍的灵敏度；或实时PCR，在实时PCR的过程中，可在2小时内快速确认结果。

在恙虫病的常规PCR诊断中，已尝试了使用各种靶蛋白基因（如47kDa、56kDa和groEL等）的PCR，相比常规PCR，更优选巢式PCR或实时PCR。因为当使用47kDa或56kDa基因作为靶标来进行常规PCR时，灵敏度低至至多10%。然而，巢式PCR具有如下缺点：由于将PCR进行了两次来增加灵敏度，因而确实需要比其它PCR更长的测试时间。同时，实时PCR具有如下缺点：由于需要非常昂贵的测试设备，在大多数医疗机构普遍使用方面存在局限。

因此，迫切需要开发一种新的诊断方法，所述诊断方法相当简单而且低成本，并呈现高灵敏度和特异性。

发明内容

技术问题

本发明人试图开发新的方法来对来自患者血液样品的恙虫病东方体进行方便易行的检测。结果，本发明人通过确认了如下内容而完成了本发明：通过对恙虫病东方体的16s核糖体RNA基因序列的一部分进行特异性扩增，甚至用现有的常规PCR，也能够实现高度准确的诊断。

因此，本发明提供了恙虫病东方体的检测方法，该方法通过使用常规PCR对恙虫病东方体的16s核糖体RNA基因进行扩增。

本发明的新方法克服了在常规PCR中灵敏度在10%以内的问题，同时还克服了在巢式PCR中进行两次或更多次PCR而导致需要更多工作量和时间以及高的污染潜在可能性的问题，并克服了在实时PCR中需要昂贵设备的问题。因此，本发明的方法在成本-工作量的效益方面是出色的方法，所述方法还提供了可与上述PCR相比拟的诊断准确度。

技术方案

为了实现上述目的，本发明人设计了恙虫病东方体的检测方法，以对恙虫病东方体的16s核糖体RNA基因序列进行扩增和鉴定。这一方法可通过制备能特异性扩增恙虫病东方体的16s核糖体RNA的引物而实现。